Пцр на хеликобактер пилори: Анализ кала ПЦР на выявление хеликобактера в Челябинске

Содержание

ПЦР диагностика helicobacter pylori — цены от 370 руб. в Краснодаре, 25 адресов

Цены: от 370р. до 1246р.

Динамика цен

25 адресов, 25 цен, средняя цена 489р.

Клиника высоких технологий WMT на Постовой

ул. Постовая, д. 33

ул. Постовая, д. 33

ПЦР Хеликобактер (Helicobacter pylori) в кале

540 р.
Сити-Клиник на Бабушкина

ул. Бабушкина, д. 37

ул. Бабушкина, д. 37

ПЦР кала на H. Pylori

649 р.
Евромед на Калинина 201

ул. Калинина, д. 201

ул. Калинина, д. 201

ПЦР ДНК Helicobacter pylori (биоптат, кал)

450 р.
Life на Восточно-Кругликовской

ул. Восточно-Кругликовская, д. 30

ул. Восточно-Кругликовская, д. 30

ПЦР кала на H. Pylori

690 р.
Еввро ЛПС на Уральской

ул. Уральская, д. 13

ул. Уральская, д. 13

ДНК хеликобактера (Helicobacter pylori)

400 р.
Евромед на КИМ

ул. КИМ, д. 143

ул. КИМ, д. 143

ПЦР ДНК Helicobacter pylori (биоптат, кал)

450 р.
Евромед на Памяти Чернобыльцев

ул. Памяти Чернобыльцев, д. 1

ул. Памяти Чернобыльцев, д. 1

ПЦР ДНК Helicobacter pylori (биоптат, кал)

450 р.
Евромед на Федора Лузана

ул. Федора Лузана, д. 19

ул. Федора Лузана, д. 19

ПЦР ДНК Helicobacter pylori (биоптат, кал)

450 р.
Шале Сантэ на Красных Партизан

ул. Красных Партизан, д. 238

ул. Красных Партизан, д. 238

ДНК хеликобактера (Helicobacter pylori)

450 р.
Здоровье и Долголетие на Александра Покрышкина

ул. Александра Покрышкина, д. 4/6

ул. Александра Покрышкина, д. 4/6

ДНК хеликобактера Helicobacter pylori

500 р.
МЦ Молодо на Красных Партизан

ул. Красных Партизан, д. 359

ул. Красных Партизан, д. 359

Хеликобактер пилори, ДНК H. pylori, кач. (кал)

530 р.
Клиника 112 на Гагарина

ул. Гагарина, д. 112

ул. Гагарина, д. 112

ДНК хеликобактера (Helicobacter pylori)

370 р.
Клиника Городская на Российской

ул. Российская, д. 267/3, корп. 1

ул. Российская, д. 267/3, корп. 1

Helicobacter pylori, ДНК [реал-тайм ПЦР]

640 р.
ЭкспрессМедСервис на Ставропольской

ул. Ставропольская, д. 96/1

ул. Ставропольская, д. 96/1

Хеликобактер пилори, определение ДНК в биоптате слизистой желудка и/или двенадцатиперстной кишки (Helicobacter pylori, DNA, Bioptates of Gastric Mucosa and/or Duodenum, PCR)

560 р.
Мелисса на Головатого

ул. Головатого, д. 174

ул. Головатого, д. 174

ДНК хеликобактера (Helicobacter pylori)

400 р.
Евромед на Кутузова

ул. Кутузова, д. 50

ул. Кутузова, д. 50

ПЦР ДНК Helicobacter pylori (биоптат, кал)

450 р.
Клиника Солнечная на Красных Партизан

ул. Красных Партизан, д. 128

ул. Красных Партизан, д. 128

ДНК Helicobacter pylori

410 р.
Здоровая нация на Рашпилевской

ул. Рашпилевская, д. 44

ул. Рашпилевская, д. 44

ДНК хеликобактера (Helicobacter pylori)

400 р.
Клиника Солнечная на Ставропольской

ул. Ставропольская, д. 210, лит. Д

ул. Ставропольская, д. 210, лит. Д

ДНК Helicobacter pylori

410 р.
Ваш Доктор на Селезнева

ул. Селезнева, д. 86/1

ул. Селезнева, д. 86/1

Helicobacter ПЦР

550 р.
G8 Center на Совхозной

ул. Совхозная, д. 1, лит. 7

ул. Совхозная, д. 1, лит. 7

Helicobacter pylori, ДНК [реал-тайм ПЦР]

880 р.
Краевой медицинский центр на 1-го Мая

ул. 1-го Мая, д. 153

ул. 1-го Мая, д. 153

исследование (176)

1246 р.
Клиника Первомайская на Евдокии Бершанской

ул. Евдокии Бершанской, д. 402/Б

ул. Евдокии Бершанской, д. 402/Б

ПЦР Хеликобактер (Helicobacter pylori) в кале

560 р.
ЧУЗ Клиническая больница РЖД-Медицина на Московской

ул. Московская, д. 96

ул. Московская, д. 96

Микроскопическое исследование материала желудка на хеликобактер пилори (Helicobacter pylori)

600 р.
Краевая клиническая больница №2

ул. Красных партизан, д. 6, корп. 2

ул. Красных партизан, д. 6, корп. 2

Определение ДНК Helicobacter pylori в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (последовательное)

662 р.

ПЦР диагностика инфекции: Helicobacter pylori.

ПЦР диагностика инфекций: Helicobacter pylori (кал)



Нарушение работы органов желудочно-кишечного тракта, что проявляется болью в животе, постоянным чувством тяжести, возникающим после еды, могут свидетельствовать о появлении в желудке или 12-перстной кишке бактерии Helicobacter pylori. Подтвердить ее присутствие в организме можно с помощью многих методов, наиболее достоверным из которых считается ПЦР (полимеразная цепная реакция) в кале. Анализ основан на обнаружении фрагментов ДНК в испражнениях.

Helicobacter pylori – бактерия, является представителем патогенной микрофлоры. В процессе своей жизнедеятельности она вырабатывает токсичные вещества, поражающие слизистую. Сначала это небольшое воспаление желудочной стенки, что изредка напоминает о себе болью в желудке, тошнотой, рвотой. С течением времени пораженные места преобразуются в язвы и эрозии, новообразования.

Как правило, заражение хелибактер происходит внутри семьи и тесного сообщества посредством слизи и слюны, то есть бытовым путем. Нарушение правил личной гигиены, пользование общей посудой и полотенцами значительно увеличивают риск «подхватить» бактерию.


Показания к проведению анализа


Носителями Helicobacter pylori – является около 70% населения. Это означает, что носительство не всегда сопровождается неприятными симптомами. Проконсультироваться у гастроэнтеролога следует при появлении таких проявлений:
  • недопереваривание белковых продуктов;
  • частые приступы рвоты;
  • постоянная тошнота и изжога после еды;
  • желудочные боли, стихающие после еды;
  • вздутие;
  • отсутствие аппетита;
  • стремительное снижение веса;
  • запор и диарея;
  • обнаружение в испражнениях и рвотных массах прожилок крови.
Рекомендуется ПЦР анализ кала при:
  • хронических патологиях органов ЖКТ, в частности язвы 12-перстной кишки или желудка, нарушение пищеварения;
  • выявлении онкопатологии желудка у близкого (кровного) родственника;
  • первичном обнаружении Helicobacter pylori у члена семьи.

Правила подготовки к исследованию кала

Самым безболезненным методом выявления бактерии Helicobacter pylori считается анализ испражнений на наличие антигена посредством ПЦР. Такое исследование идеально подходит детям и пожилым пациентам. Этот бактериальный анализ отличается высокой точностью результатов.
Основано исследование на обнаружении в образце каловых масс ДНК, то есть генетического материала, Helicobacter pylori. Диагностика проводится в режиме реального времени.
Забор испражнений рекомендуется проводить минимум через 1 месяц после последнего приема антибактериальных препаратов. За 3 дня до анализа нужно отказаться от употребления любых красящих продуктов, блюд, содержащих грубую клетчатку, а также лекарственных средств, стимулирующих кишечную перистальтику.
Собранный кал помещают в стерильный контейнер и максимально быстро доставляют в лабораторию.
На результат влияет обнаружение в биоматериале желчи и желчных кислот, следов крови, солей неорганической природы.


Результаты исследования


Проведение ПЦР исследования может предоставить либо положительные, либо отрицательные результаты.

Положительный результат указывает на присутствие в организме бактерии. Однако указать в острой форме заболевание или нет, не может.

Отрицательный результат подтверждает отсутствие Helicobacter pylori в организме больного.

Нужно отметить, что даже после эрадикации хелибактер анализ еще долгое время будет положительным, поскольку будут отходить ДНК-фрагменты погибших микроорганизмов.

Анализ на хеликобактер пилори в Москве

Что такое Helicobacter pylori?

Хеликобактер пилори – это особый вид микроорганизмов, патогенного характера. Опасная бактерия инфицирует желудок и двенадцатиперстную кишку человека. Микроорганизм представляет собой паразита, который продуцирует токсичные вещества, способные повреждать слизистые оболочки органов. Эти повреждения могут привести к язвенной болезни, гастриту и более опасным заболеваниям.

Медицина длительное время считала, что в кислой среде желудка не способен выжить ни один организм. Но бактерию хеликобактер пилори это не касается. Кислая среда обитания для нее во многом более предпочтительна. Форма Helicobacter pylori в виде спирали со жгутиками, позволяет ей передвигаться по слизистым оболочкам и нарушать их целостность, нанося непоправимый урон.

Патогенная бактерия способна выжить в любой среде. Этому способствует тот факт, что данному организм в кислороде практически не нуждается. Российскими учеными введен специальный термин – хеликобактериоз, который обозначает совокупность процессов, происходящих в организме человека, после внедрения в него данной бактерии. Западными учеными были исследованы карты больных пациентов, что позволило сделать определенный вывод – инфицированию подвержены около 65% всего населения земли. Для выявления патогенной бактерии необходимо сдать тест на хеликобактер. Хеликобактериоз – одно из самых распространенных инфекционных заболеваний, после вирусной герпесной инфекции.

Патогенный организм погибает при активном поступлении кислорода и не может существовать на воздухе. Основные пути инфицирования – слизь и слюна человека. Следовательно, заразиться можно в следующих ситуациях:

  • при использовании общей посуды;
  • при использовании одних средств, предназначенных для личной гигиены;
  • передается от матери к ребенку;
  • передается при поцелуе.

Во многом заражению способствует несоблюдение правил гигиены. Еще один весьма важный момент – необходимо поддерживать свой иммунитет на должном уровне. Хеликобактерия в каждом отдельном случае проявляет себя абсолютно по-разному. Для определения наличия патогенного организма проводится специальное исследование Helicobacter pylori, позволяющее выявить бактерию.

Когда и кому нужен анализ на Helicobacter pylori?

При возникновении у человека определенной симптоматики требуется сделать тест на Helicobacter pylori. Почти в 100% случаев при заражении бактерией возникает хронический гастрит, который и является основным проявлением патогенного организма. Среди основных симптомов выделяются:

  • появление болей в желудке. Она может быть острой, ноющей или тупой. Может присутствовать ощущение распирания. Болезненные ощущения могут менять локализацию и переходить в область двенадцатиперстной кишки;
  • появление изжоги. Жжение может локализироваться в подложечной области, пищеводе и гортани. Возможно появление болезненных ощущений в груди, которые можно легко спутать с болями сердечного характера. Довольно часто появляется гнилостный или кислый привкус;
  • частое появление отрыжки, которая может иметь кислый или горький привкус. Часто наблюдается отрыжка воздухом, которая усиливается после приема пищи;
  • частые приступы тошноты. Если этот симптом часто проявляется наряду с голодными болями, также необходимо сделать экспресс тест на Helicobacter pylori. Возможно появление тошноты натощак или по прошествии 3 часов после последнего приема пищи;
  • частое проявление аллергических реакций. Патогенная бактерия провоцирует проявление атопического дерматита, хронической крапивницы и пищевых аллергий.

Возможно проявление другой нетипичной симптоматики при сильном обсеменении организма бактерией:

  • резкое снижение аппетита или его полное отсутствие;
  • резкое похудение, которое не является нормой;
  • ощущение сухости во рту с металлическим привкусом;
  • частое образование в уголках рта болезненных заед.

Проявление перечисленной выше симптоматики является поводом сделать анализ на хеликобактер пилори и обратиться за медицинской помощью, в в Москве это можно сделать в клинике AMC-Медионика.

Диагностика

Для выявления патогенной бактерии используются различные диагностические методы:

  • цитологическое исследование является наиболее эффективным методом и представляет собой проведение эндоскопии с забором мазков и биоптат для проведения гистологического и бактериологического исследования. Специалист обращает пристальное внимание на наличие отека и гипермии. Бактерия обычно обнаруживается в центральных частях слизи. В Москве анализ на хеликобактер часто используют для диагностики заболеваний, он позволяет выявлять дисплазии, метаплазии или наличие раковых образований. Если для пациента проведение инвазивного метода является затруднительным, можно воспользоваться неинвазивными лабораторными исследованиями;
  • исследование по анализу крови позволяет определять антитела, вырабатываемые иммунной системой человека при контактировании с хеликобактер пилори. По пороговому значению объема иммуноглобулинов определяется наличие или отсутствие бактерии. При отсутствии чужеродных белков результат будет отрицательным, присутствие антигенов является маркером инфицирования;
  • ПЦР – диагностика. Наиболее чувствительный способ выявления ДНК патогенного возбудителя при исследовании кала. Правильный сбор материала обеспечит максимальную точность проведения диагностики.

Специалисты высшей квалификации и современное оборудование в клинике AMC-Медионика, позволят в самые скорые сроки поставить правильный диагноз и привести ваше здоровье в норму. При появлении симптомов запишитесь на прием к гастроэнтерологу и пройдите необходимые исследования. В AMC-Медионика цена за анализ на хеликобактер пилори наиболее оптимальная. Не откладывайте свое здоровье на «потом»!

цены, адреса клиник в Санкт-Петербурге, отзывы пациентов, запись онлайн – Spb.meds.ru

Клиника ЭнДжейМед на Петроградской

ул. Всеволода Вишневского, д. 1 | р-н Петроградский

Петроградская

Чкаловская

Многопрофильный медицинский центр “ЭнДжейМед” на Петроградской начал работу в 2015 году, специализируется в области эстетической медицины, имеет все необходимое для диагностики и лечения заболеваний в области гинекологии, урологии, флебологии, эндокринологии, дерматологии. Врачи клиники имеют высокую квалификацию, регулярно проходят дополнительное обучение, совершенствуют свои навыки.Смотреть еще »

10:00-20:00 10:00-20:00 10:00-20:00

Молекулярная идентификация ДНК Helicobacter в тканях аденокарциномы желудка человека с использованием ПЦР-амплификации 16S рРНК Helicobacter видоспецифичной и пиросеквенирования

Введение

Helicobacter pylori (H. pylori) представляет собой микроаэрофильная грамотрицательная бактерия, которая, как известно, связана с хронический гастрит, пептическая язва и аденокарцинома желудка (1). Это большое клиническое Важность идентификации микроорганизма в образцах желудка. Впоследствии существует несколько диагностических тестов.H. пилори инфекция в образцах желудка может быть продемонстрирована с помощью посев, гистологическое исследование биоптатов с различные красители, анализ активности уреазы и ПЦР с целью специфического обнаружения ДНК H. pylori (2). Анализы, основанные на использовании ПЦР для обнаружить присутствие ДНК H. pylori, используя несколько различных были описаны гены-мишени (2–10). Кроме того, хорошо известно, что ПЦР-анализ очень надежен в обнаружение H. pylori. Анализ пиросеквенирования был используется для идентификации H.pylori путем секвенирования части Ген 16S рРНК, покрывающий сигнатурную последовательность H. pylori (6). Сигнатура H. pylori последовательность позволяет отличить организм от множества другие виды бактерий (11). Этот исследование изучало возможность использования пиросеквенирования технология проверки видовой идентичности H. pylori из залитые парафином ткани резецированных аденокарцином желудка амплификация части гена 16S рРНК с использованием широкого реактивного праймеры с последующим секвенированием последовательности из 20 п.н., уникальной для ген 16S рРНК H.пилори.

Материалы и методы
Экстракция ДНК

ДНК экстрагировали из парафиновых срезов 51 резецированные аденокарциномы желудка, в том числе 21 кишечная, 24 диффузный и 6 смешанных типов. Вкратце, 50–100 мкл выделения ДНК буферный раствор [50 мМ Трис-буфер (рН 8,3), 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 5% Добавляли твин-20 и 100 мкг/мл протеиназы К] с 10% смолы. соскоб ткани и инкубируют при 56°С в течение как минимум 1 часа. После инкубации пробирки нагревали при 100°С в течение 10 мин.Пробирки центрифугировали для осаждения дебриса и 5 мкл супернатант использовали в реакции ПЦР.

ПЦР-амплификация Helicobacter pylori идентификационный номер

Для идентификации H. pylori использовались следующие праймеры: прямой, 5′-биотин-AGGGGTAAAATCCGTAGAGAT-3′ и обратный, 5′-CGTTTAGGGCGTGGACTA-3′. Последний праймер амплифицирует ДНК длиной 133 п.н. фрагмент из области «16S рРНК» H. pylori. Короче, 5 Добавляли мкл ДНК до получения 50 мкл смеси растворов для ПЦР, содержащей по 0,2 ммоль дНТФ, 1.5 ммоль/л MgCl2, 1X буфер для ПЦР, 1,5 единицы полимеразы Immolase DNA Taq (Bioline, Лондон, Великобритания) и 20 пмоль каждого праймера. ПЦР проводили в течение 5 мин при 95°С, 50 циклов (30 сек при 95°С, 30 сек при 52°С и 30 сек при 72°С) и 10 мин при 72°С на термоциклере PTC-220 (Bio-Rad, США). ПКР продукты подвергали электрофорезу в агарозном геле для подтверждения успешная амплификация продукта ПЦР.

Пиросеквенирование на Helicobacter идентификация пилори

биотинилированных продуктов ПЦР иммобилизовали в гранулы, покрытые стрептавидином (Amersham Pharmacia Biotech AB, Швеция) с использованием раствора из набора для подготовки образцов PSQ™ 96 (Pyrosequencing AB, Великобритания) по стандартному протоколу.Бусины (10 мкл) разводили в связывающем буфере с биотинилированными продуктами ПЦР и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Бусы были переносили на фильтр-зонд, и жидкость удаляли вакуумом фильтрация. ДНК разделяли в денатурационном растворе в течение 2 мин. Шаблоны промывали промывочным буфером, переносили в PSQ. 96 SQA и отжиг с праймером для секвенирования, реверс, 5′-CTCCCCA CGCTTT-3′ в буфере для отжига при комнатной температуре. Образцы анализировали с помощью системы PyroMark ID (Biotage, Великобритания). с программным обеспечением SQA и набором реагентов SQA (Biotage) для секвенирования анализ.

Результаты
Из тканей, залитых в парафин, было выделено

ДНК. из 51 резецированной аденокарциномы желудка. Праймеры для ПЦР были разработаны для амплификации ПЦР-фрагмента длиной 133 п.н. в высококонсервативных областях ген 16S рРНК. Последовательность продуктов ПЦР анализировали. с использованием системы PyroMark ID с программным обеспечением SQA и реагентом SQA Комплект. Анализ последовательности для идентификации H. pylori путем секвенирования участка гена 16S рРНК, покрывающего H. pylori была проведена сигнатурная последовательность.На рис. 1 показаны репрезентативные результаты. из анализа залитых парафином тканей 51 резецированного аденокарциномы желудка. Анализ пиросеквенирования 16S рРНК показал что H. pylori присутствовал в 47 (92,2%) из 51 желудочного аденокарциномы: 18 из 21 кишечно-, 23 из 24 диффузно- и все 6 смешанного типа. В 4 H. pylori-негативных случаев, Helicobacter cinaedi (H. cinaedi) (2 случая), Helicobacter mustelae (H. mustelae) (1 случай) и Campylobacter hyointestinalis (С. hyointestinalis) (1 случае) были обнаружены.Два H. cinaedi- и 1 C. hyointestinalis-положительные случаи были выявлены в кишечного типа, а 1 случай H. mustelae выявлен в аденокарциномы диффузного типа.

Обсуждение

Различные диагностические процедуры используются для определить H. pylori в клинических образцах. Ни один тест не оптимальный из-за продолжительности времени, необходимого для выполнения теста, отсутствие чувствительности или невоспроизводимость (5). Культуральное и гистологическое исследование образцы биопсии с использованием различных красителей и анализа на уреазу активности имеют недостатки, заключающиеся в недостаточной чувствительности и длительном инкубационные периоды.Анализы, основанные на использовании ПЦР для обнаружения присутствие ДНК H. pylori с использованием нескольких различных генов мишени показали, что ПЦР осуществима для быстрого, чувствительного и специфическое обнаружение H. pylori (2–5,7–10,12). Использование системы PyroMark ID с программным обеспечением SQA и реагентом SQA набор для амплификации участка гена 16S рРНК удалось анализировать бактериальные генетические мишени в ДНК, извлеченной непосредственно из тканей желудка человека без длительного культивирования бактерий. Впоследствии организм был дифференцирован из множества других виды бактерий (6).

H. pylori отнесены к группе I. канцероген. Предыдущие эпидермиологические исследования установили сильную причинно-следственная связь между инфекцией H. pylori и желудочно-кишечным рак (13–16). Всероссийский опрос, проведенный в г. Южная Корея в 1998 г. по серологической распространенности H. pylori. инфекции пришли к выводу, что распространенность H. pylori была 66,9% среди взрослых (≥16 лет), процент, который снизился до 59,6% в 2005 г. (17). В этом исследовании, H. pylori присутствовал в 47 (92,2%) из 51 желудочного ткани аденокарциномы от корейских пациентов.Стойкая инфекция слизистой оболочки желудка H. pylori инициирует воспалительный каскад, который прогрессирует в атрофический гастрит, состояние связано со снижением секреции желудочного сока кислотой и повышенным риском развития рака желудка (18).

Два случая инфекции H. cinaedi, 1 случай Инфекция C. hyointestinalis и 1 случай инфекции H. mustelae в 4 H. pylori-негативных случаях были отмечены в настоящем исследовании. Два H. cinaedi- и 1 C. hyointestinalis-положительные случаи были выявлены в кишечного типа и 1 H.mustelae по диффузному типу аденокарциномы. Молекулярные доказательства существования организмов H. cinaedi в 2 из 126 уреазоотрицательных биоптатов желудка человека был сообщалось ранее (19). ЧАС. cinaedi вызывает гастроэнтерит (20) и внекишечные инфекции, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом (21). C. hyointestinalis был первоначально описанный Gebhart et al. как возможная причина свиной пролиферативный энтерит (22). Впоследствии организм был выделены из фекалий людей, больных гастроэнтеритом и, в в единичных случаях из крови больных бактериемией (23).Хотя H. cinaedi и C. hyointestinalis ранее были связаны с гастроэнтерит, заболеваемость и роль этих организмов в канцерогенез желудка остается неясным. H. mustelae представляет собой желудочного патогена, который имеет множество биохимических, молекулярных и фенотипические характеристики сходны с характеристиками H. pylori (24). Инфекция H. mustelae было обнаружено усиление пролиферации желудочного эпителия, как было отмечено в инфицированных H. pylori людей, предположительно из-за хронического воспалительная реакция (25). А предыдущее исследование показало, что высокая заболеваемость опухолью, зарегистрированная в Хорьки, получавшие MNNG, отражали участие H.mustelae в канцерогенном процессе у этих животных (26). Случай, о котором сообщалось ранее связь H. mustelae и аденокарциномы желудка поддерживает гипотеза о том, что H. mustelae, сходный с H. pylori в человека, может быть желудочным коканцерогеном у хорьков (27). Однако эта гипотеза еще не быть подтверждены на людях.

Технология пиросеквенирования полезна в выявление и дифференциация H. pylori от других видов путем анализа гена, кодирующего 16S рРНК. Желудочный Ткани аденокарциномы содержат бактерии, и большинство из них представляют собой H.пилори. H. cinaedi, H. mustelae и C. hyointestinalis встречаются редко. Роль этих организмов в Патогенез аденокарциномы желудка остается неясным.

Благодарности

Это исследование было поддержано Университетом Конкук.

Ссылки

1

Blaser MJ и Parsonnet J: Parasitism от «медленная» бактерия Helicobacter pylori приводит к изменению желудочного гомеостаза и неоплазии.Джей Клин Инвест. 94:4–8. 1994.

2

Вайс Дж., Мекка Дж., да Силва Э. и Гасснер D: Сравнение ПЦР и других диагностических методов обнаружения инфекции Helicobacter pylori у больных диспепсией. Дж Клин микробиол. 32: 1663–1668. 1994. PubMed/NCBI

.

3

Clayton CL, Kleantous H, Coates PJ, Морган Д.Д. и Табакчали С.: Чувствительное обнаружение Helicobacter pylori с помощью полимеразной цепной реакции.Дж. Клин Микробиол. 30:192–200. 1992.

4

Энгстранд Л., Нгуен А.М., Грэм Д.Ю. и el-Zaatari FA: обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция амплификация рРНК для обнаружения видов Helicobacter . Дж. Клин Микробиол. 30:2295–2301. 1992. PubMed/NCBI

.

5

Хаммар М., Тышкевич Т., Вадстром Т. и O’Toole PW: Быстрое обнаружение Helicobacter pylori в биопсийный материал желудка методом полимеразной цепной реакции.Джей Клин микробиол. 30:54–58. 1992.

6

Хьялмарссон С., Олдерборн А., Фок С., Малдин I, Kling H, Uhlen M и Engstrand L: Комбинация Rapid характеристика генотипов микроорганизмов и хозяев с использованием единого технология. Хеликобактер. 9: 138–145. 2004. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

7

Хошина С., Кан С.М., Цзян В. и др.: Прямое обнаружение и амплификация Helicobacter pylori рибосомных Сегменты гена 16S из желудочной эндоскопической биопсии.Диагн микробиол Заразить Дис. 13:473–479. 1990. PubMed/NCBI

.

8

Валентайн Дж.Л., Артур Р.Р., Мобли Х.Л. и Дик Д.Д.: Обнаружение Helicobacter pylori с помощью полимеразной цепной реакции. Дж. Клин Микробиол. 29: 689–695. 1991.

9

Ван Цвет А.А., Тийс Ю.С., Коойстра-Смид А.М., Ширм Дж. и Снейдер Дж. А.: Чувствительность культуры по сравнению с полимеразной цепной реакции для обнаружения Helicobacter pylori из образцов антральной биопсии.Дж. Клин Микробиол. 31: 1918–1920. 1993. PubMed/NCBI

.

10

Ван Дж.Т., Лин Дж.Т., Шеу Дж.С., Ян Дж.С., Чен Д.С. и Wang TH: Обнаружение Helicobacter pylori в желудочном биоптат ткани методом полимеразной цепной реакции. Евр Дж Клин Микробиол Заразить Дис. 12: 367–371. 1993.

11

Eckloff BW, Podzorski RP, Kline BC и Cockerill FR III: сравнение последовательностей 16S рибосомной ДНК из пять изолятов Helicobacter pylori .Int J Syst Bacteriol. 44:320–323. 1994. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

12

Хо С.А., Хойл Дж.А., Льюис Ф.А. и др.: Прямые тест полимеразной цепной реакции для обнаружения Helicobacter pylori у людей и животных. Дж. Клин Микробиол. 29:2543–2549. 1991. PubMed/NCBI

.

13

Эль-Омар Э.М., Ойен К., Мюррей Л.С. и др.: Повышенная распространенность предраковых изменений у родственников больных раком желудка: критическая роль H.пилори . Гастроэнтерология. 118:22–30. 2000. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

14

Eslick GD, Lim LL, Byles JE, Xia HH и Тэлли, штат Нью-Джерси: Ассоциация инфекции Helicobacter pylori с карцинома желудка: метаанализ. Am J Гастроэнтерол. 94:2373–2379. 1999.

15

Лимбург П., Цяо Ю., Марк С. и др.: Helicobacter pylori серопозитивность и субсайт-специфичность риска рака желудка в Линьсяне, Китай.J Natl Cancer Inst. 93:226–233. 2001. Просмотр статьи: Google Scholar

16

Уэмура Н., Окамото С., Ямамото С. и др.: Заражение Helicobacter pylori и развитие желудочной рак. N Engl J Med. 345: 784–789. 2001. Просмотр статьи: Google Scholar

17

Ким Н, Пак Р.Ю., Чо С.И. и др.: Helicobacter pylori инфекция и развитие желудочной рак в Корее: долгосрочное наблюдение.Дж. Клин Гастроэнтерол. 42:448–454. 2008. Просмотр статьи: Google Scholar

18

Диксвед Дж., Линдберг М., Розенквист М., Энрот Х., Янссон Дж.К. и Энгстранд Л.: Молекулярная характеристика микробиоты желудка у больных раком желудка и у контролирует. J Med Microbiol. 58: 509–516. 2009. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

19

Пена Дж.А., Макнил К., Фокс Дж.Г. и Версалович J: Молекулярные доказательства микроорганизмов Helicobacter cinaedi в образцы биопсии желудка человека.Дж. Клин Микробиол. 40:1511–1513. 2002.

20

Куинн Т.К., Гуделл С.Э., Феннелл С., Ван С.П., Schuffler MD, Holmes KK и Stamm WE: Инфекции с Campylobacter jejuni и Campylobacter -подобные организмы у гомосексуальных мужчин. Энн Интерн Мед. 101:187–192. 1984.

21

Берман В.Дж., Кон Д.Л., Ревз Р.Р. и Уилсон ML: Многоочаговый целлюлит и моноартикулярный артрит, как проявления бактериемии Helicobacter cinaedi .Клин Заразить Дис. 20: 564–570. 1995. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed/NCBI

.

22

Гебхарт С.Дж., Уорд Г.Э., Чанг К. и Курц Х.Дж.: Campylobacter hyointestinalis (новый вид), выделенный из свиней с поражением пролиферативным энтеритом. Am J Vet Res. 44:361–367. 1983.

23

Ластовица А.Я.: Campylobacter / Бактеремия Helicobacter в Кейптауне, Южная Африка, 1977–1995 годы.Кампилобактеры, хеликобактерии и родственные им Организмы. Ньюэлл Д.Г., Кетли Дж.М. и Фельдман Р.А.: Plenum Press; Новый Йорк: стр. 475–479. 1996 г., Просмотр статьи : Google Scholar

24

Fox JG, Edrise BM, Cabot EB, Beaucage C, Murphy JC и Prostak KS: Campylobacter -подобные организмы выделены из слизистой оболочки желудка хорьков. Am J Vet Res. 47:236–239. 1986.

25

Ю Дж., Рассел Р. М., Саломон Р. Н., Мерфи Дж. К., Palley LS и Fox JG: Эффект Helicobacter mustelae инфекции на пролиферацию эпителиальных клеток желудка хорьков.Канцерогенез. 16: 1927–1931. 1995.

26

Фокс Дж.Г., Корреа П., Тейлор Н.С., Ли А., Отто G, Murphy JC и Rose R: Helicobacter mustelae связаны гастрит у хорьков: животная модель Helicobacter pylori гастрит у человека. Гастроэнтерология. 99: 352–361. 1990.

27

Fox JG, Dangler CA, Sager W, Borkowski R и Gliatto JM: Helicobacter mustelae -ассоциированный желудочный аденокарцинома у хорьков ( Mustela putorius furo ).Ветеринар Патол. 34:225–229. 1997. Просмотр статьи : Google Scholar

.

Границы | Сравнение диагностической эффективности количественной ПЦР, секвенирования по Сэнгеру и полногеномного секвенирования при определении устойчивости Helicobacter pylori

к кларитромицину и левофлоксацину.

Инфекция H. pylori является основным фактором, определяющим этиологию различных желудочно-кишечных заболеваний, включая хронический активный гастрит, пептическую язву или язву двенадцатиперстной кишки, аденокарциному желудка и тканевую лимфому, ассоциированную со слизистой оболочкой.Кларитромицин в сочетании с метронидазолом или амоксициллином и ингибитором протонной помпы (Gisbert et al., 2000; Malfertheiner et al., 2017; Marques et al., 2020) был ключевым препаратом первой линии H. pylori. Схема эрадикации в течение более десяти лет. Тем не менее, широкое использование кларитромицина привело к увеличению числа резистентных к кларитромицину H. pylori , снижению эффективности обычных схем лечения первой линии и увеличению случаев неэффективности лечения из-за лекарственно-устойчивых штаммов H. pylori.pylori (Wueppenhorst et al., 2009; Buzás, 2010; Thung et al., 2016). Тенденция к росту устойчивости к кларитромицину у H. pylori наблюдается во всем мире и, в частности, в европейских странах, при этом общий уровень первичной устойчивости к кларитромицину составляет 17–21% (de Francesco et al., 2010; Dolak et al., 2017). ; Билжильер и др., 2018). Хотя резистентность к левофлоксацину не так широко изучалась, существует также тенденция к увеличению первичной и вторичной резистентности к левофлоксацину у H.pylori (Hug and Rossi, 2001; Mandell et al., 2007). С ростом уровня устойчивости к антибиотикам полезность применяемой в настоящее время стратегии «тестируй и лечи» ставится под сомнение, что подчеркивает необходимость быстрой и точной диагностики для оценки лекарственной устойчивости H. pylori до введения антибиотиков.

Устойчивость к кларитромицину у H. pylori в основном связана с тремя точечными мутациями (A2146C, A2146G и A2147G) в 23S рДНК (Zullo et al., 2007; Боянова и др., 2010; Мегро, 2012 г.; Saracino et al., 2012), а мутации в гене гиразы ( gyrA ; в основном в кодонах 87 и 91) связаны с устойчивостью к левофлоксацину (Boyanova et al., 2010). Несмотря на успехи в диагностике H. pylori , культуральное фенотипическое тестирование лекарственной чувствительности (ТЛЧ) по-прежнему является наиболее часто применяемым методом. Однако успешное выделение и культивирование H. pylori из образцов биопсии желудка представляет собой сложную задачу, которую затрудняет ряд технических факторов (например,g., качество клинического образца, присутствие микробной комменсальной флоры, неподходящие условия транспортировки) (Cuadrado-Lavín et al., 2012). Кроме того, культуральные методы требуют высококвалифицированного лабораторного персонала, а получение результатов занимает до 14 дней. Быстрые и точные молекулярные методы, которые могут обнаружить H. pylori и оценить его лекарственную устойчивость, становятся все более важными в диагностике с ростом устойчивости к антибиотикам.

Кроме того, полногеномное секвенирование (WGS) успешно применялось для обнаружения мутаций, приводящих к фенотипической лекарственной устойчивости у H.pylori (Боянова и др., 2010). Благодаря достижениям в технологии секвенирования (например, доступным ценам на инструменты, удобным и простым рабочим процессам, стандартизации протоколов и реагентов, разумным затратам на образец) диагностические лаборатории могут секвенировать культуральные изоляты в клинически значимые сроки (от 24 до 48 часов), обеспечивая комплексное представление о генотипе и соответствующих мутациях лекарственной устойчивости бактериального изолята (Redondo et al., 2018; Lauener et al., 2019). Тем не менее, основным остающимся ограничением WGS является то, что он по-прежнему в основном выполняется на культуральных изолятах, поскольку применение метагеномных подходов непосредственно к биопсии желудка затруднено из-за низкого содержания бактериальной ДНК и высокого фона человеческой ДНК (особенно для методов выделения ДНК без истощения). ДНК человека).

На сегодняшний день имеется лишь несколько коммерчески доступных молекулярных анализов для обнаружения мутаций в 23SrDNA (эти тесты являются преобладающими) (например, LightMix Modular Helicobacter 23S rDNA, Genotype HelicoDR) и генов gyrA , а некоторые — были опубликованы собственные тесты (Schabereiter-Gurtner et al., 2004; Cambau et al., 2009; Bilgilier et al., 2018; Lauener et al., 2019; Makristathis et al., 2019; Jehanne et al., 2020). ). В частности, количественные анализы ПЦР в реальном времени (кПЦР) в сочетании с анализом кривой плавления позволяют своевременно оценить H.pylori и его образцы с лекарственной устойчивостью (Schabereiter-Gurtner et al., 2004; Gazi et al., 2013; Bénéjat et al., 2018, Redondo et al., 2018), однако опубликованные данные ограничены 23SrDNA. Дизайн количественной ПЦР для gyrA остается сложной задачей из-за высокой изменчивости последовательности H. pylori (Ailloud et al., 2019; Estibariz et al., 2019). На сегодняшний день, насколько нам известно, только Genotype HelicoDR (Cambau et al., 2009) используется в качестве коммерческого теста (с маркировкой CE-IVD) для комбинированного обнаружения различных мутаций 23SrDNA и gyrA .Однако этот коммерческий набор основан на длительной ПЦР не в реальном времени с последующей гибридизацией, которая включает множество этапов инкубации (Jehanne et al., 2020). Кроме того, гибридизационные зонды, основанные на анализе гена gyrA (которые должны различать вариации последовательности в 1 п.н., но только в соответствующих кодонах 87 и 91), противоречат вышеупомянутому исключительному генетическому разнообразию (Ailloud et al., 2019; Estibariz et al. ., 2019).

Целями данного исследования являются всестороннее сравнение различных методов (культурального и молекулярного) с целью применения количественной ПЦР для своевременного и чувствительного тестирования чувствительности к кларитромицину, а также левофлоксацину параллельно непосредственно из биопсии желудка без культивирования (которому препятствуют различные недостатки).В частности, для количественной ПЦР gyrA недостаточно данных (также для культивируемых изолятов). Кроме того, наличие актуальных данных из Центральной Европы о прямом тестировании молекулярной чувствительности в биоптатах желудка показывает довольно высокий (от 22% до 29%) процент резистентности к кларитромицину, а также резистентность к левофлоксацину, которая может быть связана с отбором. неоптимальной антибиотикотерапии пациента (Kenyon, 2019).

Материалы и методы

Клинические

H.pylori Изоляты и H. pylori Культура

Это исследование проводилось с использованием набора из 76 штаммов H. pylori из коллекции бактериальных штаммов Института медицинской микробиологии (IMM) Цюрихского университета. Штаммы H. pylori были выделены в период с 2013 по 2017 год из образцов биопсии желудка, которые были отправлены в IMM для фенотипического ТЛЧ на основе культуры. Для этого исследования штаммов H. pylori были намеренно отобраны на основе их фенотипа устойчивости к противомикробным препаратам и, следовательно, не являются репрезентативными для H.pylori эпидемиология первичной антибиотикорезистентности в Швейцарии. После оттаивания штаммы инкубировали на чашках с агаром для бруцелл собственного производства (с 5% лошадиной крови) в течение 3 дней при 37°C в микроаэробных условиях (90% N 2 , 5% CO 2 , 5% O 2 ) с использованием газогенератора (CampyGen, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Через 3 дня изолятов H. pylori пересевают на чашки с агаром для бруцелл, чтобы получить биомассу, достаточную для Е-теста ® (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Франция), и провести экстракцию ДНК для WGS.

Фенотипическое ТЛЧ с помощью E-Test

®

Культуры H. pylori были скорректированы по стандарту McFarland, равному 3 (Yuen et al., 2005). McFarland, равный 3, был выбран, поскольку H. pylori является прихотливым бактериальным патогеном, и для оценки результатов Е-теста требуется достаточный рост на чашках с прихотливым агаром Мюллера-Хинтона (MHF). В диагностической лаборатории учитывали ранее опубликованный протокол тестирования фенотипической чувствительности прихотливых организмов (King, 2001).Фенотипическое ТЛЧ проводили на чашках с агаром MHF, содержащих 5% лошадиной крови (bioMérieux), с использованием следующих Е-тестов ® (bioMérieux): кларитромицин (0,016–256 мг/л) и левофлоксацин (0,016–32 мг/л). Чашки с агаром инкубировали в микроаэробных условиях при 37°С в течение 3 дней. Впоследствии МИК определяли с помощью светового микроскопа (Leica M80, Leica Microsystems, Heerbrugg, Швейцария). Интерпретацию чувствительности проводили в соответствии с рекомендациями Европейского комитета по тестированию чувствительности к противомикробным препаратам (Redondo et al., 2018).

Экстракция ДНК, количественная ПЦР и анализ кривой плавления

ДНК была выделена из немодифицированных (т. е. без фиксации или заливки) образцов биопсии желудка (собраны в 2018 г.) с использованием мини-набора QIAamp DNA (номер заказа 51304, Qiagen, Hilden, Germany) с расщеплением протеиназой К, в соответствии с рекомендациями производителя. Желудочные биоптаты имели диаметр 1-3 мм и продолжительность инкубации протеиназы К составляла не менее 1 часа для полного растворения. Клинические образцы были получены от клиентов (т.г., гастроэнтеролог) диагностической лаборатории доктора Риша без каких-либо выделений. ДНК экстрагировали из изолятов H. pylori с помощью набора DNeasy ® UltraClean ® Microbial Kit (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с рекомендациями производителя.

Для количественной ПЦР-амплификации 23S рДНК экстрагированную ДНК добавляли к смеси, состоящей из воды Roche PCR-grade (Roche, Rotkreuz, Switzerland), LightCycler ® DNA Multiplex Master Mix (Roche), 0,25 мкл урацил-ДНК-гликозилазы (Sigma Aldrich, Швейцария) и праймеры и зонды рДНК LightMix ® Modular Helicobacter 23S (TIBMolbiol, Берлин, Германия).Мы следовали рекомендациям по составу qPCR Mastermix и протоколу амплификации, предоставленному TIBMolbiol. КПЦР 23S рДНК проводили на LightCycler 480-II ® (Roche) с последующим анализом кривой плавления.

Для количественной ПЦР-амплификации гена gyrA праймеры Fujimura et al. (2004). Кроме того, были разработаны новые праймеры, нацеленные на те же самые сайты связывания праймеров, но с учетом вариаций последовательностей, обнаруженных в клинических образцах из разных мест в Швейцарии (клиенты группы CLM Dr Risch).Четыре различных прямых праймера: Hp gyrA-f1 5′-CGATGCATGAATTAGGYCTTACT-3′, Hp gyrA-f5 5′-CGATGCATGAATTAGGCCTCACT-3′, Hp gyrA-f6 5′-CGATGCATGAATTAGGGCTTACT-3′ и Hp gyrA-f8 5′-CGATGCATGAATTAGGCCTTACC -3′, и 2 обратных праймера, Hp gyrA-r 5′-TTCTTCACTCGCCTTRGTCAT-3′ и Hp gyrA-r4 5′-TTCTTCGCTCGCTTTGGTCAT-3′. Для амплификации gyrA кПЦР экстрагированную ДНК добавляли к смеси, состоящей из воды Roche PCR-grade (Roche), LightCycler ® 480 SYBR Green I Mastermix (Roche), 0.25 мкл урацил-ДНК-гликозилазы (Sigma Aldrich) и каждого праймера в конечной концентрации 0,5 мкМ. GyrA кПЦР проводили на приборе LightCycler 480-II ® (Roche) со следующими настройками циклера: 95°C в течение 10 мин и 45 циклов 95°C в течение 10 с, 58°C в течение 10 с и 72 цикла. °С в течение 20 с. Анализ кривой плавления проводили от 60°C до 90°C с непрерывным детектированием. Время при различных температурах соответствовало рекомендациям, приведенным на листке-вкладыше полимеразы.Температуры отжига (5 различных температур от 57°C до 66°C) тестировали с использованием контроля ДНК Vircell Amplirun Helicobacter pylori (номер заказа MBC049, распространяемый Ruwag, Bettlach, Швейцария). Кривая плавления была построена после количественной ПЦР, чтобы отличить специфические и неспецифические продукты ПЦР.

Для секвенирования сайтов связывания праймеров gyrA из клинических образцов с менее эффективной амплификации gyrA , чем 23S рДНК, использовали следующие праймеры: прямой 5′-GGATTGATTCTTCTATTGAAGAGA-3′ и обратный 5′-AAAGGTTAGGCAGACGGCTTGGTA-3′ , что приводит к фрагменту длиной 465 п.н.Этот фрагмент длиной 465 п.н. секвенировали (с использованием прямого праймера) и выравнивали с использованием ClustalOmega. Разница в точках пересечения (Cp) между gyrA -ПЦР и 23SrДНК-ПЦР составляла не менее 2,62 при среднем значении 6,84 (что указывает на менее эффективную амплификацию). Средняя разница в значениях Cp других образцов составляла менее 1 цикла. Выравнивание таких последовательностей показано ниже (рис. 1). Настройки мастер-микса и циклера были эквивалентны, но температура отжига составляла 55°C вместо 58°C.

Рисунок 1 Выравнивание с ClustalOmega фрагмента гена gyrA для разработки новых праймеров для амплификации. Отсутствующие звездочки указывают на вариации последовательности. Последовательности двух праймеров «Hp gyrA-f1» и «Hp gyrA-r» основаны на предыдущей публикации (Fujimura et al., 2004). Цифры (слева) указывают на различные биопсии желудка. Обратные праймеры показаны в этой ориентации, чтобы определить положение праймеров.

Анализ Genotype HelicoDR

Анализ Genotype HelicoDR (Hain Lifesciences GmbH, Нерен, Германия) (Cambau et al., 2009) выполняли в соответствии с рекомендациями производителя и оценивали как интерпретируемую, если показывали положительный сигнал гибридизации с конъюгатом и контролем амплификации. Анализ считали не интерпретируемым, если он не показывал гибридизационный сигнал с конъюгатным контролем или контролем амплификации. Образец считался положительным, если были видны три контрольные полосы HP, gyrA и 23S. Полоса (дикий тип или мутация) считалась положительной, если полоса была по крайней мере такой же интенсивной, как контроль амплификации.Однако указано, что интенсивность контрольной полосы амплификации может варьироваться в зависимости от количества используемой ДНК. Точной количественной оценки интенсивности полос не проводилось. Таким образом, сообщение о результате зависело от вовлеченного лица. Кроме того, во вкладыше к упаковке указано, что отсутствие полосы gyrA87Wt или полосы gyrA91Wt указывает на наличие резистентности. Если возникает смешанная инфекция, могут присутствовать по крайней мере 2 полосы либо кодона 87, либо кодона 91. Полоса gyrA87MUT обнаруживает N87K, но только с AAA в качестве кодона, а не с AAG.Другие мутации в кодоне 87 распознаются только по отсутствию всех полос gyrA87. Таким образом, смесь последовательности дикого типа и последовательности с мутацией, отличной от ААА, для кодона 87 будет давать неверный отчет. Для кодона 91 тест HelicoDR обнаруживает D91N, D91G и D91Y. По данным производителя, однократное несовпадение с зондом приводит к потере сигнала гибридизации (Hain Lifescience: личное сообщение).

Секвенирование по Сэнгеру продуктов количественной ПЦР

gyrA

Все продукты количественной ПЦР gyrA секвенировали с использованием четырех прямых праймеров, перечисленных выше.Продукты ПЦР очищали с помощью набора HighPure PCR Product Purification Kit (Sigma Aldrich), а секвенирование по Сэнгеру выполняли Microsynth (Balgach, Швейцария) в соответствии с их рекомендациями. Последовательности выравнивали с помощью онлайн-инструмента ClustalOmega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

Подготовка библиотеки и WGS штаммов

H. pylori

Подготовка библиотеки выполнялась с использованием набора ДНК Qiagen ® QIAseq FX (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с рекомендациями производителя.Качество библиотеки секвенирования и распределение по размеру были проанализированы на автоматизированной системе анализа фрагментов CE (Advanced Analytical Technologies Inc., Heidelberg, Germany) в соответствии с инструкциями производителей с использованием набора анализатора фрагментов 474 HS Next Generation Sequencing (NGS). Библиотеки для секвенирования объединяли в эквимолярных концентрациях и секвенировали парные концы (2×150 п.н.) на платформе Illumina MiSeq (Illumina ® , Сан-Диего, Калифорния, США).

Необработанные считывания секвенирования (fastq) были отфильтрованы и обрезаны с использованием инструмента триммера FASTQ из FASTX-Toolkit (Hannon Laboratory, Cold Spring Harbour Laboratories) с применением порогового балла PHRED, равного 25.Чтобы идентифицировать SNP в генах, придающих устойчивость, файлы fastq были проанализированы с использованием конвейера ARIBA (Malfertheiner et al., 2017) путем запроса специальной базы данных последовательностей генов, полученных из эталонного штамма 26695 H. pylori (эталонная последовательность NCBI: NC_000915.1).

Результаты

Оценка собственной

gyrA qPCR, а также qPCR для 23SrDNA в сравнении с HelicoDR на основе гибридизации с использованием биопсии желудка

GyrA qPCR24 продукты имели длину qPCR24.Было определено, что температура плавления (Tm) конкретных продуктов составляет от 82,0 до 84,5 °C из-за большого разнообразия последовательностей (рис. 1) клинических образцов (выравнивание всех положительных образцов не показано). Результаты сравнивались с тестом HelicoDR, и результаты биопсии желудка, описанные в этой публикации, являются результатами обычной диагностики CLM Dr Risch Group, сообщаемой врачам.

ДНК из 142 образцов биопсии желудка (104 положительных и 38 отрицательных образцов) была проанализирована с помощью gyrA кПЦР с последующим секвенированием по Сэнгеру, и Genotype HelicoDR показал 100% совпадение положительных и отрицательных результатов.Наилучшее совпадение (с использованием NCBIBlast) для секвенирования по Сэнгеру gyrA всегда было H. pylori , показывая высокую специфичность. Что касается определения чувствительности или устойчивости, между двумя тестами наблюдалось больше различий (таблица 2). Аминокислотные обмены, приводящие к устойчивости, были обнаружены в 20 образцах с gyrA qPCR и Genotype HelicoDR. С помощью количественной ПЦР с последующим секвенированием по Сэнгеру было обнаружено 23 образца с заменой аминокислот, приведшей к резистентности.Эти 23 образца содержали следующие мутации: N87I 2 раза, N87K 8 раз, D91N 5 раз, D91G 5 раз и D91Y 3 раза. HelicoDR специально обнаруживает только N87K, D91N, D91G и D91Y. В одном клиническом образце обнаружена мутация N87T; однако эта мутация фенотипически восприимчива (Lauener et al., 2019). Всего было получено 8 противоречивых результатов между двумя анализами (таблица 1). Один из этих образцов показал замену аминокислот N87K в гене gyrA с кодоном AAG, идентифицированным секвенированием по Сэнгеру, но без сигнала гибридизации с генотипом HelicoDR.Отсутствие сигнала гибридизации в Genotype HelicoDR связано с тем, что мутационный зонд для кодона 87 gyrA обнаруживает только кодон AAA для лизина. Кроме того, два клинических образца были проанализированы как чувствительные к генотипу HelicoDR, в то время как аминокислотные замены были обнаружены с помощью количественной ПЦР gyrA в сочетании с секвенированием по Сэнгеру. Первый из этих двух клинических образцов показал гибридизационный сигнал с зондом gyr87Wt4. Однако сигнал был явно слабее, чем интенсивность других зондов, что указывает на неэффективную гибридизацию. GyrA qPCR и секвенирование по Сэнгеру выявили обмен N87I, который не должен показывать гибридизационный сигнал с генотипом HelicoDR. Второй образец четко показал обмен D91G с ​​ gyrA qPCR и секвенированием по Сэнгеру. Соответствующий анализ Genotype HelicoDR показал очень слабый сигнал гибридизации ниже порогового уровня, и поэтому был оценен как чувствительный. Примечательно, что было пять образцов, которые показали слабые сигналы гибридизации для мутации gyrA с помощью анализа Genotype HelicoDR (таблица 1), но не показали мутацию с помощью секвенирования по Сэнгеру.Поскольку нет количественного измерения полос теста HelicoDR и, следовательно, нет количественного сравнения с контрольными полосами, интерпретация таких результатов по-прежнему зависит от вовлеченного человека.

Таблица 1 Сравнение количественной ПЦР (в сочетании с секвенированием по Сэнгеру) и HelicoDR для gyrA с использованием биоптатов желудка, положительных на H. pylori .

Таблица 2 Сравнение количественной ПЦР и HelicoDR для 23S рДНК с использованием биоптатов желудка, положительных на H.пилори .

Кроме того, 76 клинических образцов были проанализированы как чувствительные с помощью обоих тестов.

Несколько различных (молчащих) мутаций были обнаружены за пределами кодонов 87 и 91 с помощью gyrA qPCR. Замена в кодоне 88 (GCA вместо кодона GCG) не вызывала сигнала гибридизации с зондом gyrA87 в Genotype HelicoDR (см. рис. 2, пример взят из разных клинических образцов). Согласно инструкции по эксплуатации от Hain, образцы, в которых отсутствует сигнал гибридизации с зондами gyrA или 23S рДНК, следует интерпретировать как устойчивые.Для этого образца отсутствие аминокислотной замены gyrA87 не имело значения для прогнозирования устойчивости к левофлоксацину, поскольку присутствовал дополнительный gyrA91 (D91N). Второй образец эквивалентно показал замену в кодоне 85 (GGA вместо кодона GGC) с дополнительной заменой аминокислоты в кодоне 91 (D91N), предотвращая ложное предсказание устойчивости. На основании этих результатов следует ожидать расхождений (например, мутация только в кодонах, смежных с кодоном 87 или 91, приводящая к отсутствию полос в тесте гибридизации, что следует интерпретировать как устойчивое согласно вкладышу в упаковке).Дополнительный клинический образец (не вошедший в статистику) подтверждает это утверждение (рис. 2).

Рисунок 2 Гибридизационный анализ образца биопсии желудка. Секвенирование по Сэнгеру показывает дикий тип для обоих кодонов 87 и 91 и GCA для кодона 88, тогда как наиболее частой последовательностью для кодона 88 является GCG. Последовательность GGCGATAA(C/T)GCAGTTTAT (кодоны с 85 по 90 с AAC или AAT для наиболее распространенного кодона 87) с GCA для кодона 88 показывает 100% совпадение только для 5 записей с NCBI Blast (номера доступа CP022409.1, CP032043.1, CP032818.1, MK348877.1, CP002332.1: база данных за август 2019 г.).

Интересно, что было два клинических образца с последовательностями дикого типа (Sanger) в кодонах 87 и 91, но с аминокислотными изменениями E104G или V107I. Данные о фенотипической устойчивости для этих двух образцов отсутствовали. Кроме того, было 12 образцов со смешанными последовательностями в кодонах 87 или 91 (определено с помощью количественной ПЦР и секвенирования по Сэнгеру): это были либо два разных кодона дикого типа, либо кодоны дикого типа и мутированные кодоны.Как правило, 24% биопсий желудка были зарегистрированы как устойчивые к левофлоксацину с помощью теста HelicoDR, а соответствующее значение для количественной ПЦР и секвенирования по Сэнгеру составило 22%.

Кроме того, была оценена согласованность между результатами количественной ПЦР 23S рДНК и результатами Genotype HelicoDR, которая показала высокую согласованность (26 устойчивых, 74 чувствительных и 4 противоречивых) (таблица 2). При количественной ПЦР для 23S рДНК один клинический образец был положительным в отношении Cp 37, о чем HelicoDR сообщал как об отрицательном. В 23S рДНК кПЦР 26 устойчивых к кларитромицину образцов включали 3 A2146G (11.5%) и 16 мутаций A2147G (61,5%), а 7 образцов с гетерорезистентностью включали 1 A2146C и дикого типа (3,9%), 2 A2146G и дикого типа (7,7%), и 4 A2147G и дикого типа (15,4%). Сообщается, что 4 несовместимых образца чувствительны к 23S rDNA qPCR и показали очень слабые сигналы гибридизации в Genotype HelicoDR. Для gyrA интерпретация недельных полос зависит от опыта вовлеченного человека. Как правило, 28,8% биоптатов желудка были зарегистрированы как устойчивые к кларитромицину с помощью теста HelicoDR, и соответствующее значение для количественной ПЦР составило 25%.

Результаты посева и чувствительности 142 биопсий желудка недоступны, но корреляция может быть обоснованно сделана на основе данных, полученных из изолятов.

Определение устойчивости к кларитромицину с помощью 23S rDNA qPCR и WGS с использованием культивируемых изолятов на основе фенотипического ТЛЧ. 23S rDNA qPCR выявила следующие мутации в 49 резистентных к кларитромицину штаммах

H.pylori : 1 A2146C (2%), 12 A2146G (24%), 34 A2147G (70%) и 2 H. pylori с гетерорезистентностью (4%; дикий тип и A2146G и дикий тип и A2147G) (рис. 3 и 4).

Рисунок 3 Кривая плавления после количественной ПЦР для 23S рДНК. Желтый: смесь A2147G (52%) и дикого типа (48%). Количественную оценку (%) проводили с помощью WGS. Синий: Дикий тип. Серый: A2147G. Оранжевый: -К. Пик при 70°C можно не учитывать (по данным поставщика).

Рисунок 4 Кривая плавления после количественной ПЦР для 23S рДНК.Желтый: смесь A2146G (62%) и дикого типа (38%). Количественную оценку (%) проводили с помощью WGS. Синий: Дикий тип. Серый: A2146G. Оранжевый: -К. Пик при 70°C можно не учитывать (по данным поставщика).

WGS выявил следующие замены нуклеотидов в 49 изолятах H. pylori : 1 A2146C (2%), 14 A2146G (31%) и 32 A2147G (67%) (таблица 3). Два изолята H. pylori с гетерорезистентностью, идентифицированной с помощью количественной ПЦР 23S рДНК, были подтверждены с помощью WGS [один образец с диким типом (38%) и A2146G (62%), а второй образец с диким типом (48%) и A2147G (52%). %)].Оба изолята H. pylori показали МИК кларитромицина 256 мг/л в культуральном фенотипическом ТЛЧ. Поскольку H. pylori несет две копии рДНК 23S, эти два образца могут также содержать ген H. pylori с гетерорезистентностью (т. е. одну рДНК дикого типа и одну мутированную рДНК 23S).

Таблица 3 Определение устойчивости к кларитромицину с помощью фенотипического тестирования лекарственной чувствительности (ТЛЧ) 23S rDNA qPCR и WGS в 76 изолятах H. pylori .

Определение устойчивости к левофлоксацину с помощью

gyrA КПЦР в сочетании с секвенированием по Сэнгеру и WGS с использованием культивируемых изолятов

Двадцать восемь из 76 H.pylori (37%) были определены как устойчивые к левофлоксацину и 48/76 (63%) чувствительные с помощью культурального фенотипического ТЛЧ. Различные замены аминокислот были обнаружены в кодонах 87 и 91 с помощью gyrA qPCR и последующего секвенирования по Сэнгеру и WGS (таблицы 4 и 5). Мы обнаружили смешанные последовательности в кодонах 87 и 91 для некоторых изолятов H. pylori с помощью обоих методов (таблица 5, рисунок 5). Единственным расхождением результатов между gyrA qPCR в сочетании с секвенированием по Сэнгеру и WGS был смешанный результат H.pylori с кодонами 87 и 91 дикого типа, а также следующие 2 замены аминокислот: N87Y и D91N, где WGS не идентифицировал замену D91N. Более того, один изолят H. pylori был определен как устойчивый с помощью культурального фенотипического ТЛЧ с МИК левофлоксацина 32 мг/л, но не показал замены аминокислот в кодонах 87 или 91.

Таблица 4 Определение устойчивости к левофлоксацину с помощью фенотипического тестирования лекарственной чувствительности (ТЛЧ), gyrA qPCR в сочетании с секвенированием по Сэнгеру и WGS в 76 H.pylori изолятов.

Таблица 5 Идентифицированные аминокислотные изменения в гене gyrA 28 устойчивых к левофлоксацину штаммов H. pylori .

Рисунок 5 Хроматограмма секвенирования по Сэнгеру. Красная полоса обозначает кодон 87. WGS: позиция 87, AAG (70%) и AAA (30%). AAA был ниже порогового значения для WGS (обнаружено 8x, пороговое значение составляло 10x). AAG и AAA кодируют Lys.

Обсуждение

В этом исследовании мы стремились сравнить различные методы определения лекарственной устойчивости у H.пилори . Мы обнаружили очень хорошее соответствие между молекулярными и фенотипическими результатами для культивируемых изолятов.

Предсказание фенотипической устойчивости к лекарственным средствам у H. pylori менее сложно, чем для других грамотрицательных бактерий, поскольку лекарственная устойчивость основана на четко определенных точечных мутациях в конкретных генах-мишенях и не передается механизмами устойчивости на плазмидах или других мобильных элементов (Lauener et al., 2019).

WGS и количественная ПЦР с секвенированием по Сэнгеру имеют очень хорошую согласованность.Имеются небольшие различия в отношении чувствительности к смешанным последовательностям, вероятно, из-за того, что подготовку библиотеки для WGS проводили непосредственно из изолятов H. pylori всего за 10 циклов амплификации. Чувствительность смешанных последовательностей описана Folkvardsen et al. (2013), которые сообщили, что 10% резистентности не обнаруживались при секвенировании по Сэнгеру. К сожалению, нет данных о том, приводит ли «низкочисленная мутация» к фенотипической резистентности H.пилори . Предыдущее исследование (Redondo et al., 2018) показало, что между фенотипическим и молекулярным тестированием устойчивости существует высокая согласованность.

Из-за больших вариаций последовательности в гене gyrA даже в положениях, смежных с кодонами 87 и 91, только ПЦР SYBRGreen с последующим секвенированием по Сэнгеру дает хорошие результаты для быстрого обнаружения мутаций, и новые праймеры должны быть добавлены к количественной ПЦР, если эффективность амплификации gyrA qPCR ниже, чем 23SrDNA qPCR.Айлуд и др. (2019) и Estibarez et al. (2019) сообщили, что H.pylori характеризуется исключительно высоким генетическим разнообразием и изменчивостью. Наши результаты относительно секвенирования по Сэнгеру gyrA согласуются с этим открытием. Мы заключаем, что тест с ограниченным набором гибридизационных зондов ок. Длина 20 п.н. («Технология полосы ДНК» от Hain Lifescience: (Cambau et al., 2009)), которая должна иметь дискриминацию в 1 п.н., недостаточна для обнаружения гена gyrA с очень высоким временным или пространственным разнообразие последовательностей.Это может быть причиной отсутствия очень хороших коммерческих анализов гена gyrA.

Тот факт, что в одном фенотипически левофлоксацин-резистентном изоляте H. pylori (МИК 32 мг/л) не было обнаружено мутаций gyrA в кодоне 87 или 91, может указывать на то, что могут иметь место и другие механизмы резистентности. . Смит и др. (2014) сообщают, что кодоны 87 и 91 являются наиболее значимыми сайтами мутаций, но не исключительными.

Для ОТ-ПЦР время получения результатов после выделения ДНК было менее 1 рабочего дня; для 23S рДНК – менее 2 ч (настройка и ПЦР).Требуемое практическое время намного меньше, чем для анализа HelicoDR (Hain Lifescience).

Как ПЦР в реальном времени, так и последующее секвенирование gyrA -ПЦР-позитивных образцов являются экономически эффективными и быстрыми (Таблица 6). Затраты (рассчитанные только на расходные материалы) для обоих методов ПЦР в реальном времени снижаются с увеличением количества образцов в цикле. По-видимому, классическая культура остается самым дешевым методом по сравнению с используемыми молекулярными методами. Однако очевидные преимущества описанных молекулярных методов прямого выявления мутаций в биоптатах желудка оправдывают более высокие затраты.Напротив, WGS явно дороже, чем qPCR.

Таблица 6 Сравнение характеристик анализа фенотипической лекарственной чувствительности (ТЛЧ), количественной ПЦР и анализа кривой плавления, секвенирования по Сэнгеру и полногеномного секвенирования (WGS).

Из-за растущей тенденции к высокой первичной и вторичной резистентности к левофлоксацину у H. pylori (Zullo et al., 2007; Boyanova et al., 2010; Cuadrado-Lavín et al., 2012; Saracino et al., 2012 ), рекомендуется анализировать ген gyrA в дополнение к проведению количественной ПЦР для 23S рДНК.Эта рекомендация подтверждается результатами биопсии желудка (прямое обнаружение) с резистентностью 22-24% к левофлоксацину и 25-29% к кларитромицину (диапазон обусловлен небольшой разницей между двумя тестовыми процедурами).

Поскольку ген gyrA является однокопийным геном (Tomb et al., 1997), смешанные последовательности всегда представляют собой смешанные инфекции. Секвенирование по Сэнгеру показало наличие 4 смешанных инфекций (5,2%) среди 76 культивируемых изолятов на основе разнообразия последовательностей гена gyrA .

В обзорной статье, посвященной африканским исследованиям (Jaka et al., 2018), указывается очень широкий процент устойчивости к кларитромицину (от 0 до 100%) при общем уровне устойчивости 29,2%. Кроме того, в этом обзоре заявлена ​​устойчивость к хинолонам от 0 до 32% при общей устойчивости 17,4% (Jaka et al., 2018). В другом обзоре (Savoldi et al., 2018) сообщается, что в Европейском регионе общая устойчивость к кларитромицину составляет 32 %, а к левофлоксацину — 14 %. В другом исследовании (Megraud et al., 2013) с данными по Европе заявлена ​​устойчивость к кларитромицину на уровне 17.5% и резистентность к левофлоксацину 14,1%, однако в странах Северной Европы процент обычно ниже. Наши данные показывают, что резистентность к кларитромицину, которая была обнаружена непосредственно при биопсии желудка, остается высокой, как ранее было обнаружено в одном из двух обзоров. Однако в отношении резистентности к левофлоксацину (прямое обнаружение также при биопсии желудка) наши данные показывают повышенный процент устойчивых к левофлоксацину инфекций H. pylori . Поскольку использование кПЦР для 23SrДНК преобладает (т.е., без анализа gyrA (Bénéjat et al., 2018)), можно предположить, что назначение левофлоксацина в тех многочисленных случаях с выявленной резистентностью к кларитромицину может привести к отбору мутаций gyrA (Marques et al., 2020). Доказано, что количественные ПЦР имеют клиническое значение, позволяя избежать трудностей культивирования (Bénéjat et al., 2018). Параллельное тестирование (кПЦР для 23SrDNA и gyrA ) дает возможность адекватного лечения антибиотиками, поскольку для лечения можно использовать и другие классы антибиотиков (Lauener et al., 2019) даже для случаев с двойной устойчивостью (кларитромицин и левофлоксацин).

Заключение

Поскольку успешное выделение и культивирование H. pylori из образцов биопсии желудка является сложной задачей, затрудняемой рядом технических факторов, а также длительной, это полезно для своевременного лечения пациента иметь адекватный молекулярный тест, который позволяет проводить тестирование резистентности непосредственно при биопсии желудка. Тем временем применение количественной ПЦР хорошо зарекомендовало себя и, следовательно, приводит к появлению новых диагностических инструментов.В частности, новая количественная ПЦР (23SrDNA и gyrA ) и секвенирование (по Сэнгеру) ( gyrA ) могут преодолеть недостатки культур и должны применяться для обнаружения H. pylori в биоптатах желудка. Два оцененных теста qPCR для 23S rDNA и gyrA намного быстрее, чем посев, чувствительны, специфичны, включают предотвращение переноса и были обширными, включая культивированные изоляты, а также прямое обнаружение из биопсии желудка. Из-за высокого процента резистентности как к левофлоксацину, так и к кларитромицину, которая была непосредственно обнаружена в биоптатах желудка (от 22% до 29%), обе мишени необходимо анализировать параллельно.Кроме того, из-за большого количества вариаций последовательности в гене gyrA ПЦР SYBRGreen с последующим секвенированием по Сэнгеру в настоящее время является лучшим и самым быстрым доступным молекулярным методом. WGS полностью поддерживает результаты количественной ПЦР с использованием культивируемых изолятов. Для прямого обнаружения H. pylori в биоптатах желудка у WGS есть ограничение, заключающееся в том, что большое количество ДНК человека может снизить чувствительность двух соответствующих мишеней.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, можно найти в NCBI GenBank, номер доступа NCBIMW057345-51. Данные о последовательности из WGS перечислены в Lauener FN, Imkamp F, Lehours P, Buissonnière A, Benejat L, Zbinden R, Keller PM, Wagner K (2019) Генетические детерминанты и прогнозирование фенотипов устойчивости к антибиотикам у Helicobacter pylori. Джей Клин Мед 8:53. дои: 10.3390/jcm8010053.

Вклад авторов

KE: концептуализация, методология, проверка, исследование, ресурсы и написание. KW: методология, проверка, ресурсы и написание. ПК: ресурсы, обзор и редактирование.LR: приобретение финансирования. MR: приобретение финансирования. ТБ: администрирование проекта и концептуализация. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Настоящая научная работа финансируется организациями, указанными для авторов, в основном «labormedizinisches zentrum Dr Risch».

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим техников Института медицинской микробиологии, особенно Валерию П. Пирес, за квалифицированную помощь и содействие. Мы благодарим Институт медицинской микробиологии Цюрихского университета за постоянную поддержку.

Ссылки

Ailloud F., Didelot X., Woltemate S., Pfaffinger G., Overmann J., Bader R.C., et al. (2019). Эволюция Helicobacter pylori внутри хозяина, сформированная нишевой специфической адаптацией, внутрижелудочными миграциями и селективными перемещениями. Нац. коммун. 10 (1), 2273. doi: 10.1038/s41467-019-10050-1

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Билжильер К., Штадльманн А., Макристатис А., Таннесбергер Дж., Кастнер М.-Т., Кнофлах П. и др. (2018). Проспективное многоцентровое клиническое исследование меж- и внутрипациентной генетической изменчивости устойчивости Helicobacter pylori к противомикробным препаратам. клин. Микробиологическая инфекция. 24, 267–272. doi: 10.1016/j.cmi.2017.06.025

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Боянова Л., Николов Р., Гергова Г., Евстатьев И., Лазарова Е., Камбуров В. и др. (2010). Тенденции двух десятилетий первичной резистентности Helicobacter pylori к антибиотикам в Болгарии. Диагностическая микробиология и инфекционные болезни. Диагн. Микробиологическая инфекция. Дис. 67, 319–326. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2010.03.010

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Бузас Г. М. (2010). Эрадикация Helicobacter pylori первой линии: стандартная тройная терапия устарела? Другая точка зрения. Мир Дж. Гастроэнтерол. 16, 3865–3870. doi: 10.3748/wjg.v16.i31.3865

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Cambau E., Allerheiligen V., Coulon C., Corbel C., Lascols C., Deforges L., et al. (2009). Оценка нового теста GenoType HelicoDR для молекулярного выявления устойчивости Helicobacter pylori к антибиотикам. Дж. Клин. Микробиол 47, 3600–3607. doi: 10.1128/JCM.00744-09

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Куадрадо-Лавин А., Salcines-Caviedes J.R., Carrascosa M.F., Mellado P., Monteagudo I., Llorca J., et al. (2012). Антимикробная чувствительность Helicobacter pylori к шести антибиотикам, используемым в настоящее время в Испании. J. Антимикробная химиотерапия. 67, 170–173. doi: 10.1093/jac/dkr410

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

де Франческо В., Джорджио Ф., Хассан С., Манес Г., Ваннелла Л., Панелла С. и др. (2010). Устойчивость H. pylori к антибиотикам во всем мире: систематический обзор. J. Gastrointest Liver Dis. 19, 409–414.

Google Scholar

Долак В., Билжильер К., Штадлманн А., Лейнер Дж., Пюспок А., Плишнеггер В. и др. (2017). Многоцентровое проспективное исследование диагностической эффективности нового жидкостного быстрого уреазного теста для диагностики инфекции Helicobacter pylori EK 1548/2014 EK. Гут Патог 9, 1–5. doi: 10.1186/s13099-017-0226-5

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Эстибариз И., Оверманн А., Айлуд Ф., Кребес Дж., Йозенханс К., Суэрбаум С. (2019). Метилтрансфераза JHP1050 основного генома m5C (M.Hpy99III) играет важную роль в управлении экспрессией генов Helicobacter pylori. Рез. нуклеиновых кислот. 47, 2336–2348. doi: 10.1093/nar/gky1307

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Фолквардсен Д. Б., Свенссон Э., Томсен В., Расмуссен Э. М., Банг Д., Вернгрен Дж. и др. (2013). Могут ли молекулярные методы выявить 1% резистентность к изониазиду у микобактерий туберкулеза? Дж.клин. Микробиол 51, 1596–1599. doi: 10.1128/JCM.00472-13

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Fujimura S., Kato S., Iinuma K., Watanabe A. (2004). In vitro активность фторхинолона и мутация гена gyrA в штаммах Helicobacter pylori, выделенных от детей. J. Med. Микробиол 53, 1019–1022. doi: 10.1099/jmm.0.45642-0

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Гази С., Карамерис А., Христофору М., Агнантис Н., Роккас Т., Стефану Д. (2013). Обнаружение методом ПЦР в реальном времени и количественный анализ устойчивых к кларитромицину штаммов Helicobacter pylori в архивных материалах и корреляция с Сиднейской классификацией. Энн. Гастроэнтерол. 26, 226–232.

Реферат PubMed | Google Scholar

Гисберт Дж. П., Гонсалес Л., Кальвет Х., Гарсия Н., Лопес Т., Роке М. и др. (2000). Ингибитор протонной помпы, кларитромицин и либо амоксициллин, либо нитроимидазол: метаанализ эрадикации Helicobacter pylori. Алимент Фармакол. тер. 14, 1319–1328. doi: 10.1046/j.1365-2036.2000.00844.x

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Хуг Б.Л., Росси М. (2001). Годовой обзор бактериальной пневмонии в центральной больнице Люцерна, Швейцария. Швейцарский мед. Неделя 131, 687–692.

Реферат PubMed | Google Scholar

Яка Х., Ри Дж. А., Эстлунд Л., Смарт Л., Пек Р., Мюллер А. и др. (2018). Величина устойчивости Helicobacter pylori к антибиотикам в Африке и выявленные мутации, придающие устойчивость к антибиотикам: систематический обзор и метаанализ 1–10.doi: 10.1186/s12879-018-3099-4

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Жанна К., Бенежа Л., Мегро Ф., Бессед Э., Леурс П. (2020). Оценка ПЦР-анализа Allplex TM H pylori и ClariR для обнаружения Helicobacter pylori в биоптатах желудка 1–3. doi: 10.1111/hel.12702

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кеньон К. (2019). Международный журнал инфекционных заболеваний. Потребление макролидов среди населения связано с устойчивостью Helicobacter pylori к кларитромицину: экологический анализ. Междунар. Дж. Заразить. Дис. 85, 67–69. doi: 10.1016/j.ijid.2019.05.028

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Кинг А. (2001). Рекомендации по тестам на чувствительность прихотливых организмов и требующих особого обращения. J. Антимикробный. Чемотер. 48, 77–80. doi: 10.1093/jac/48.suppl_1.77

Полный текст CrossRef | Google Scholar

Лауэнер Ф. Н., Имкамп Ф., Лехорс П., Буиссоньер А., Бенежат Л., Збинден Р. и др.(2019). Генетические детерминанты и прогнозирование фенотипов устойчивости к антибиотикам Helicobacter pylori. Дж. Клин. Мед. 8, 53. doi: 10.3390/jcm8010053

CrossRef Full Text | Google Scholar

Макристатис А., Хиршль А. М., Мегро Ф., Бессед Э. (2019). Обзор: Диагностика инфекции Helicobacter pylori. Хеликобактер 24, 1–7. doi: 10.1111/hel.12641

CrossRef Full Text | Google Scholar

Malfertheiner P., Megraud F., O’Morain C., Gisbert J.P., Kuipers E.J., Axon A., et al. (2017). Ведение инфекции Helicobacter pylori — консенсусный отчет Maastricht V/Florence. Гут 66, 6–30. doi: 10.1136/gutjnl-2016-312288

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Mandell L.A., Wunderink R.G., Anzueto A., Bartlett J.G., Campbell G.D., Dean N.C., et al. (2007). Американское общество инфекционных заболеваний/Американское торакальное общество. Консенсусные рекомендации по ведению внебольничной пневмонии у взрослых. клин. Заразить. Дис. 44, С27–С72. doi: 10.1086/511159

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Маркес А.Т., Витор Х.М.Б., Сантос А., Олеастро М., Вейл Ф.Ф. (2020). Тенденции устойчивости Helicobacter pylori к кларитромицину: от фенотипического к геномному подходу. Микробиологический. Genomics 6, 3. doi: 10.1099/mgen.0.000344

CrossRef Full Text | Google Scholar

Меграуд Ф., Коэнен С., Верспортен А., Кист М., Лопес-Бреа М., Hirschl A.M., et al. (2013). Устойчивость Helicobacter pylori к антибиотикам в Европе и ее связь с потреблением антибиотиков. Гут 62, 34–42. doi: 10.1136/gutjnl-2012-302254

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Мегро Ф. (2012). Проблема устойчивости Helicobacter pylori к антибиотикам: возвращение квадротерапии на основе висмута. Терапия Adv. Гастроэнтерол. 5, 103–109. doi: 10.1177/1756283X11432492

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Редондо Дж.Дж., Келлер П.М., Збинден Р., Вагнер К. (2018). Новая ОТ-ПЦР для обнаружения Helicobacter pylori и идентификации устойчивости к кларитромицину, опосредованной мутациями в гене 23S рРНК. Диагн. Микробиологическая инфекция. Дис. 90, 1–6. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2017.09.014

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Сарачино И. М., Зулло А., Холтон Дж., Кастелли В., Фиорини Г., Заккаро К. и др. (2012). Высокая распространенность первичной устойчивости к антибиотикам у изолятов Helicobacter pylori в Италии. J. Gastrointest Liver Dis. 21, 363–365.

Google Scholar

Савольди А., Каррара Э., Грэм Д.Ю., Конти М., Такконелли Э. (2018). КЛИНИЧЕСКИЙ — ПИЩЕВОЙ ТРАКТ Распространенность антибиотикорезистентности Helicobacter pylori: гастроэнтерология. Helicobacter 155, 1372–82.e17. doi: 10.1053/j.gastro.2018.07.007

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Schabereiter-Gurtner C., Hirschl A.M., Dragosics B., Hufnagl P., Puz S., Kovách Z., et al.(2004). Новый ПЦР-анализ в реальном времени для выявления инфекции Helicobacter pylori и одновременного определения чувствительности образцов кала и биопсии к кларитромицину. Дж. Клин. Микробиол 42, 4512–4518. doi: 10.1128/JCM.42.10.4512-4518.2004

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Смит С. М., О’Морейн К., Макнамара Д. (2014). Тестирование чувствительности Helicobacter pylori к противомикробным препаратам в периоды повышения устойчивости к антибиотикам. Мир Дж.Гастроэнтерол. 20, 9912–9921. doi: 10.3748/wjg.v20.i29.9912

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Thung I., Aramin H., Vavinskaya V., Gupta S., Park J.Y., Crowe S.E., et al. (2016). Обзорная статья: Глобальное появление устойчивости Helicobacter pylori к антибиотикам. Алимент Фармакол. тер. 43, 514–533. doi: 10.1111/apt.13497

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Томб Дж. Ф., Уайт О., Керлаваж А.R., Clayton R.A., Sutton G.G., Flelschmann R.D., et al. (1997). Erratum: Полная последовательность генома желудочного патогена Helicobacter pylori (Nature (1997) 388 (539-547)). Nature 389, 412.

Google Scholar

Wueppenhorst N., Stueger H.P., Kist M., Glocker E. (2009). Идентификация и молекулярная характеристика клинических изолятов Helicobacter pylori с тройной и четырехкратной устойчивостью в Германии. J. Антимикробная химиотерапия. 63, 648–653. дои: 10.1093/jac/dkp003

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Юэн Б., Збинден Р., Фрид М., Бауэрфайнд П., Бернарди М. (2005). Восстановление культуры и определение чувствительности Helicobacter pylori к противомикробным препаратам с использованием коммерческих транспортных и изоляционных сред. Инфекция 33, 77–81. doi: 10.1007/s15010-005-4071-y

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Зулло А., Перна Ф., Хассан К., Риччи К., Сарачино И., Морини С. и др. (2007). Первичная устойчивость к антибиотикам у штаммов Helicobacter pylori, выделенных в северной и центральной Италии. Алимент Фармакол. тер. 25, 1429–1434. doi: 10.1111/j.1365-2036.2007.03331.x

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Гнездовой ПЦР, специфичный для Helicobacter pylori, для обнаружения мутации 23S рРНК, связанной с устойчивостью к кларитромицину

Helicobacter pylori — грамотрицательная бактерия, обитающая в желудке человека.1 Этот микроорганизм играет важную роль в патогенезе не только персистирующего гастрита, но также пептических язв и рака желудка. 2–5 Ликвидация H. pylori может снизить риск язвенной болезни и карциномы желудка. 6 Консенсус Национального института здравоохранения Конференция по развитию рекомендовала добавлять антимикробные агенты к антисекреторным препаратам (ингибиторы протонной помпы или блокаторы H 2 ) для лечения пациентов с язвенной болезнью, связанной с инфекцией H. pylori .Эти антибиотики включают амоксициллин, кларитромицин и метродидазол, а показатели эрадикации, достигаемые за одну неделю тройной терапии, превышали 90 %. устойчивы к кларитромицину и 10–50% к метронидазолу. 11–14 При анализе неэффективности лечения на основе кларитромицина Cayla et al. сообщили, что эрадикация была достигнута у 3/10 (30%) устойчивых к кларитромицину штаммов по сравнению с 77/93 (83%) чувствительных к кларитромицину штаммов.15 Debets-Ossenkopp и соавт. сообщили, что 11 из 15 случаев неудачной эрадикации были связаны с резистентностью к кларитромицину. 16 Эти наблюдения свидетельствуют о важности оценки лекарственной устойчивости до и после лечения.

Недавно Versalovic et al показали, что мутация аденина (A) в гуанин (G) в 2143 или 2144 домене V гена 23S рРНК H. pylori связана с устойчивостью к кларитромицину. Они также установили анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов полимеразной цепной реакции (ПЦР-ПДРФ) с использованием праймеров, консервативных среди большинства бактерий. 17 Однако оценка устойчивости к кларитромицину с помощью этого анализа требует предварительного посева бактерий и занимает от пяти до шести дней. Ген 23S рРНК хорошо консервативен среди различных видов бактерий, и загрязнение будет мешать анализу.

Цель настоящего исследования состояла в создании системы ПЦР, которая амплифицирует сегмент гена 23S рРНК, содержащий точки мутации, с праймерами, специфичными для H. pylori , так что инфекция H. pylori и мутация, связанная с устойчивостью к кларитромицину можно обследовать одновременно.

Материалы и методы

бактериальные штаммы и питательные среды

Пятьдесят семь штаммов H pylori были выделены из образцов биопсии желудка у японских пациентов до лечения, и образцы биопсии были культивированы на колумбийском агаре с 5% (об./об.) лошадиной крови. и добавку антибиотиков Dent (Oxoid, Basingstoke, UK) при 37°C в течение пяти дней в микроаэробных условиях (Campy-Pak Systems; BBL, Cockeysville, Maryland). Микроорганизмы были идентифицированы как H pylori по морфологии окрашивания по Граму, морфологии колоний и положительной активности уреазы, каталазы и оксидазы.Изоляты хранили при -80°C в бульоне для бруцелл с 5% (об./об.) эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), содержащей 16% (об./об.) глицерина. Кроме того, 31 штамм, устойчивый к кларитромицину, и 27 чувствительных штаммов, для которых предварительно была определена минимальная ингибирующая концентрация (МИК), были извлечены из замороженных запасов и использованы.

Образцы желудочного сока

Образцы желудочного сока аспирированы одноразовыми назогастральными зондами у 39 пациентов для сравнения результатов ПЦР на уреазу А (УРА)18 19 и 23S рРНК ПЦР.Дополнительные образцы от 28 пациентов до лечения и 85 пациентов после лечения были использованы для клинического применения.

подготовка ДНК

Культуральную среду центрифугировали в течение пяти минут при 10 000 g и из осадков выделяли геномную ДНК из изолятов H. pylori с использованием SepaGene (Sanko Junyaku, Япония). Из образцов желудочного сока, чтобы избежать возможного влияния веществ, содержащихся в желудочном соке, H pylori сначала был захвачен кроличьим антителом против H pylori (Dako A/S, Дания), иммобилизованным на полистироловых шариках.После элюции из гранул ДНК экстрагировали с помощью SepaGene. ДНК хранили при -20°C до использования в качестве матриц для ПЦР.

Анализ последовательности гена 23s рРНК

Чтобы изучить консервативность нуклеотидов в области, фланкирующей положения 2143 и 2144 23S рРНК, мы амплифицировали сегмент длиной приблизительно 330 п. GTGCGAAATTC-CTTGTCGG-3′, соответствующий позиции 23S рРНК H pylori 2015–2034) и 23SR (5′-GACCGCCCAGTCAAACT-3′, позиции 2343–2326).Продукты ПЦР клонировали в pCRII с использованием оригинального набора для клонирования ТА (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния). Нуклеотидную последовательность вставки определяли методом терминации дидезоксицепи.20

специфические праймеры для

h pylori и амплификация

После анализа консервативности последовательности среди семи клинически выделенных штаммов H pylori и специфичности последовательности для H pylori по сравнению с другими бактериями, представленными в GenBank, мы выбрали один смысловой праймер. , CRF-4 (5′-AGTGGAGGTGAAAATTCC-3′, соответствующий H pylori 23S рРНК в положении 2105–2123), и два антисмысловых праймера, CRR-1 (5′-TAAGAGCCAAAGCCCTTAC-3′, положение 2239–2221), и CRR-3 (5′-ATTCCCATTAGCAGTGCT-3′, положение 2189–2172).Таким образом, был разработан новый полугнездовой ПЦР-анализ с использованием CRF-4/CRR-1 в качестве первого и CRF-4/CRR-3 в качестве внутренних праймеров для ПЦР (анализ 23S рРНК ПЦР). Цикл ПЦР состоял из денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжига при 50°С в течение 30 секунд и удлинения при 72°С в течение одной минуты: выполняли 30 циклов для первой и 20 циклов для второй ПЦР-амплификации.

обнаружение гена urea в образцах желудочного сока

ДНК из образцов желудочного сока также анализировали с использованием праймеров, установленных в гене ureA , описанном ранее (URA PCR)18 19, и результаты сравнивали с результатами ПЦР-анализа 23S рРНК.

специфичность праймеров

Специфичность в отношении H pylori новых праймеров для ПЦР, CRF-4/CRR-1 и CRF-4/CRR-3, оценивали путем тестирования перекрестной реакции с образцами ДНК, выделенными из 12 видов бактерий другие чем H. pylori . Эти виды бактерий были золотистый стафилококк , стафилококковой эпидермальный , кишечной палочки , синегнойной , стрептококк Пирролидонилпептидаза , Strept тШз , гемофильной рагатЦиепгае , Campylobacter jejuni , Aspergillus Flavus , Proteus mirabilis , Klebsiella pneumoniae и Branhamella catarrhalis .

обнаружение мутации 23s рРНК, связанной с устойчивостью к кларитромицину

Для обнаружения мутаций от A до G в положениях 2143 и 2144 гена 23S рРНК продукты ПЦР расщепляли 5 ед. MboII и BsaI при 37°C и 55°C соответственно в течение два часа. Продукты ПЦР, содержащие мутацию 2143 A в G, показали два продукта меньшего размера после расщепления MboII, продукты, содержащие мутацию 2144 A в G, показали два продукта меньшего размера после расщепления BsaI, а продукты, не содержащие мутации, показали нерасщепленный ампликон.

определение мик к кларитромицину

Чувствительность изолятов H pylori к кларитромицину оценивали методом разведения в агаре. Двадцать семь штаммов без мутации и шесть штаммов с мутацией были протестированы и определена МИК. МИК также определяли у 31 штамма из замороженных запасов.

клиническое применение

Клиническая применимость ПЦР 23S рРНК оценивалась в общей сложности у 85 пациентов, получавших лечение против H. pylori . Инфекция H pylori была подтверждена до лечения с помощью посева, микроскопии, экспресс-теста на уреазу и ПЦР-анализа URA. 23S рРНК-ПЦР выявила ген с мутациями или без них у всех субъектов до лечения. Пролечено 78 пациентов; в таблице 1 приведены схемы лечения. Исход антимикробной терапии оценивали более чем через восемь недель после завершения лечения. Образцы желудочного сока аспирировали с помощью эндоскопов или назогастральных струн, и мутации в положениях 2143 и 2144 гена 23S рРНК H pylori оценивали, как описано ранее.

Таблица 1

Схемы лечения

Статистический анализ

Использовался точный критерий вероятности Фишера. Значение p<0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Анализ последовательности гена 23s рРНК

Анализ последовательности между 2042 и 2281 гг. гена 23S рРНК H pylori в семи клинических изолятах показал, что в некоторых положениях наблюдались частые нуклеотидные мутации, в то время как другие были хорошо консервативны. Нуклеотиды отличались от стандарта по двум позициям во всех клинических изолятах.Один штамм (TN-5) имел резистентность, связанную с мутацией 2144 A в G (рис. 1).

Рисунок 1

Последовательность гена 23S рРНК в семи штаммах H. pylori. 23S представлял собой последовательность, указанную в GenBank (номер доступа U27270). Двоеточия обозначают личность.

ПЦР-амплификация

Праймеры, используемые для ПЦР-анализа 23S рРНК, CRF-4, CRR-1 и CRR-3, были разработаны для нацеливания на области, консервативные в штаммах H pylori , но не общие для других бактерий. Используя 10 нг ДНК, выделенной из культуры, все образцы ДНК из 57 изолятов H. pylori показали положительную амплификацию с помощью ПЦР на первом этапе.Результаты ПЦР 23S рРНК в образцах желудочного сока совпали с результатами анализа ПЦР URA в 37/39 образцах. Важно отметить, что восемь образцов, отрицательных в ПЦР-анализе URA, также были отрицательными в ПЦР-анализе 23S рРНК. Таким образом, явных ложных срабатываний не было (табл. 2). Специфичность ПЦР-анализа 23S рРНК также подтверждалась отсутствием перекрестной реакции с образцами ДНК, полученными из 12 видов бактерий, отличных от H pylori .

Таблица 2

Сравнение ПЦР 23S рРНК и ПЦР URA с использованием образцов желудочного сока

Обнаружение мутаций

Продукты ПЦР 23S рРНК инкубировали с двумя рестрикционными ферментами, MboII и BsaI.Было исследовано 85 пациентов до лечения, и в целом у 8 из 85 (9%) была точечная мутация, связанная с резистентностью к кларитромицину. Только один образец был расщеплен MboII, что указывает на мутацию 2143 A в G. Семь образцов были расщеплены с помощью BsaI, что указывает на мутацию 2144 A в G. На рис. 2 показаны типичные примеры. Как и ожидалось, шесть из восьми штаммов оказались устойчивыми к кларитромицину методом разбавления в агаре. Остальные два не тестировались, потому что культура не была доступна.Двадцать девять из 31 штамма, которые были извлечены из замороженных запасов и ранее определены как устойчивые к кларитромицину с помощью МИК, имели мутацию 2144, и только один штамм имел мутацию 2143. Оставшийся штамм не имел мутации ни 2143, ни 2144. Двадцать семь штаммов, чувствительных к кларитромицину методом разведения в агаре, не имели мутации ни 2143, ни 2144 (рис. 3).

Рисунок 2

Обнаружение мутации A в G. Продукты ПЦР из четырех штаммов расщепляли MboII (дорожки 1–4) и BsaI (дорожки 1’–4′).Штамм 2 имел мутацию от A до G в 2143 (дорожка 2), штамм 1 имел мутацию от A в G в 2144 (дорожка 1′), а штаммы 3 и 4 не имели мутаций ни в 2143, ни в 2144.

Рисунок 3

Связь между мутацией от A до G в 2143/2144 и MIC. Все штаммы с мутацией 2143/2144 были устойчивы к кларитромицину по МИК. Один штамм был устойчив по MIC, но не имел мутации. Те, у кого не было мутаций, были восприимчивы к кларитромицину по МИК.

клиническое применение

Мутации в гене H pylori 23S рРНК выявлены в 8/85 (9%) образцах, полученных до лечения.Тридцать девять пациентов, в том числе трое инфицированных мутантными штаммами, получали схемы лечения без кларитромицина. Эрадикация была достигнута у 1/3 (33%) пациентов с мутантной инфекцией и у 12/36 (33%) пациентов с инфекцией дикого типа (NS). После лечения устойчивая мутантная инфекция была подтверждена у двух пациентов, у которых до лечения были мутантные штаммы, но все 24 пациента с инфекцией дикого типа до лечения все еще носили дикие типы. Тридцать девять других пациентов лечили схемами, содержащими кларитромицин; у пяти были мутантные штаммы до лечения.Эрадикация была достигнута у 2/5 (40%) пациентов с мутантной инфекцией и у 29/34 (85%) пациентов с инфекцией дикого типа (p<0,05). ПЦР-анализ 23S рРНК после лечения выявил мутации резистентности к кларитромицину у 3/3 (100%) пациентов с мутантной инфекцией до лечения и у 2/5 (40%) пациентов с инфекцией дикого типа до лечения. Таким образом, доля мутантной инфекции среди этой группы увеличилась с 5/39 (13%) до 5/8 (63%) (табл. 3).

Таблица 3

Результат клинического применения

Обсуждение

Мы разработали анализ, который может обнаруживать инфекцию H. pylori с высокой чувствительностью и одновременно оценивать устойчивость к кларитромицину.Поскольку гены 23S рРНК довольно консервативны среди различных видов бактерий, при использовании неспецифических праймеров на ПЦР-амплификацию ДНК, непосредственно выделенной из биопсии желудка или образцов желудочного сока, может влиять ген 23S рРНК других бактерий. Таким образом, обнаружение мутаций в гене 23S рРНК, связанных с устойчивостью к кларитромицину, с помощью консенсусных праймеров требует культивирования перед выделением ДНК и ПЦР-ПДРФ; это занимает около 10 дней. Напротив, наш новый анализ не требует посева и может быть завершен всего за 12 часов, одновременно оценивая инфекцию H pylori и устойчивость к кларитромицину.Высокая чувствительность анализа была обусловлена ​​хорошей консервативностью последовательностей, на которые нацелены его праймеры, среди штаммов H pylori . Семикратность амплификации ПЦР также была важна для ее высокой чувствительности. Новая ПЦР 23S рРНК и ПЦР URA совпали в 37/39 образцах желудочного сока. Важно отметить, что ПЦР с 23S рРНК не дала ложноположительных результатов.

Сообщалось, что резистентность к кларитромицину H. pylori обусловлена ​​точечной мутацией 23S рРНК Versalovic et al .19 Мы подтвердили, что этот вывод также относится к изолятам H. pylori в Японии. Мы протестировали 37 штаммов, устойчивых к кларитромицину, и 27 штаммов, чувствительных, согласно определению МИК; 36/37 устойчивых штаммов и 0/27 восприимчивых штаммов имели мутацию. Эти результаты показывают, что большинство штаммов, устойчивых к кларитромицину, имеют мутации в гене 23S рРНК. Однако один штамм, устойчивый к кларитромицину, не имеет мутации в положениях 2143 или 2144 как по нашему анализу, так и по анализу последовательности (данные не показаны), и механизм устойчивости еще предстоит изучить.

В настоящем исследовании у 36 из 38 (95%) штаммов с мутацией, связанной с устойчивостью к кларитромицину, обнаружена мутация от A до G в положении 2144, и только у 2/38 (5%) — в положении 2143. Недавно Stone et al. показали, что более высокий уровень устойчивости был связан с мутацией A в G в 2143.21 Семь штаммов, исследованных в этом исследовании, имели значения МИК более 50 мкг/мл, а МИК других устойчивых штаммов колебалась от 3 до 32 мкг/мл. мл. Относительно низкий уровень MIC у изолятов может быть связан с высокой распространенностью мутации от A до G в положении 2144 в Японии.Хотя общая распространенность штаммов, устойчивых к кларитромицину, одинакова в Японии и странах Запада, разница в положении мутации могла повлиять на показатели эрадикации при лечении на основе кларитромицина. Для подтверждения этих наблюдений потребуются дальнейшие клинические испытания с использованием этого анализа.

Недавно сообщалось, что мутация от A до C в положении 2143 также была связана с устойчивостью к кларитромицину.21 Авторы также сообщили, что 7% штаммов, устойчивых к кларитромицину, имели эту мутацию.Наш анализ не может обнаружить мутацию от A до C. Однако в 37 устойчивых к кларитромицину изолятах, определенных с помощью МИК, мы не обнаружили штамма с мутацией от А до С, и чувствительность анализа представляется практически достаточной, по крайней мере, в Японии. Необходимо изучить клиническую применимость этого анализа в других странах. Чтобы создать более чувствительную систему обнаружения, мы разрабатываем тест для обнаружения всех мутаций, связанных с устойчивостью к кларитромицину.

Лечение против H pylori кларитромицином вместе с амоксициллином и ингибитором протонной помпы является одним из текущих стандартных протоколов.Однако несколько исследований показали, что H. pylori может стать резистентной к кларитромицину после неудачного лечения на основе кларитромицина.15 16 Действительно, настоящее исследование генотипически подтвердило появление резистентности к кларитромицину. Также было показано, что уровни эрадикации, достигаемые схемами на основе кларитромицина, значительно различались между мутантными инфекциями и инфекциями дикого типа. Таким образом, схемы, не содержащие кларитромицин, могут быть предпочтительнее в случаях инфекций, вызванных мутантным штаммом H. pylori .Распространенность мутантной инфекции, вероятно, будет высокой среди случаев, когда первоначальное лечение на основе кларитромицина не привело к эрадикации, и в таких случаях оценка мутации будет более важной. ПЦР 23S рРНК, которая не требует посева и может использовать образцы желудочного сока, может быть полезна в этих обстоятельствах.

В заключение, мы разработали высокочувствительный полугнездовой ПЦР как для обнаружения инфекции H pylori , так и для оценки мутации 23S рРНК, связанной с устойчивостью к кларитромицину.При использовании образцов желудочного сока анализ является быстрым (в течение ночи) и менее инвазивным (нет необходимости выполнять биопсию), и пациентов можно лечить адекватными антибиотиками, основываясь на информации о резистентности инфекционного организма.

Благодарности

Частично представлен на собрании Американской гастроэнтерологической ассоциации в Вашингтоне, округ Колумбия, 10–16 мая 1997 г. SpringerPlus

Период исследования: август 2009 г. – апрель 2010 г.

Этическое одобрение было получено от NIMR-IRB, в то время как информированное согласие было получено от пациентов до того, как были взяты образцы стула.

Критерии включения: пациенты, не принимающие антибиотики или ИПП/блокаторы гистамин-2-рецепторов по крайней мере за месяц до исследования, а также имеющие симптомы диспепсии.

Критерии исключения: те, кто в настоящее время принимает антибиотики и/или ИПП/блокаторы рецепторов гистамина 2.

Клинические образцы

Метод отбора проб: Удобный отбор проб.Для этого исследования использовались образцы стула 97 пациентов с диспепсией в LUTH. Образцы стула собирали стерильными зубочистками в пробирки Эппендорф, содержащие 700 мкл абсолютного этанола, при комнатной температуре. Образцами считались H . pylori – положительный, когда гена glmM или оба гена ( glmM и cagA ) были обнаружены с помощью ПЦР, и результаты сравнивались с результатами УБТ в качестве золотого стандарта и подтверждающего теста.

УБТ

Для экрана УБТ, H .Тестирование pylori проводили с использованием валидированной системы Heliprobe (Noster AB, Швеция). Heliprobe UBT представляет собой дыхательный тест на основе мочевины 14 C для выявления инфекции H. pylori . Он состоит из капсулы Helicap TM, которая содержит 14 C-меченую мочевину, которая проглатывается и метаболизируется до диоксида углерода и аммиака ферментом уреазой, продуцируемым H. pylori . Помеченный 14 C выдыхаемый воздух фиксируется картой дыхания и анализируется автоматическим анализатором вертолета.Уровни выше 50 импульсов/мин считались положительными при инфекции H. pylori .

Stool-PCR

Ген 16SrRNA (399 bp)

Вкратце, ДНК из образцов стула очищали с помощью набора QIAamp® DNA Stool Mini (Hilden, Германия), содержащего ингибитор EX (удаляет все вещества, повреждающие ДНК, и ингибиторы ПЦР в стуле) и обнаружены с помощью ПЦР-анализа, нацеленного на фрагмент 399  п.н. гена 16S рРНК Helicobacter spp. с двумя специфическими праймерами: Heli F (AAC GAT GAA GCT TCT AGC TTG CTA G) и Heli R (GTG CTT ATT CST NAG ATA CCG TCA T) (Germani et al.1997). ПЦР проводили с использованием набора гранул Ready To-Go PCR компании GE Healthcare (Букингемшир, Великобритания). Амплификацию проводили в градиенте Eppendorf Mastercycler (Гамбург, Германия) с использованием следующих параметров циклирования: начальная денатурация при 94°С в течение 5 мин и 35 циклов: 94°С в течение 30 с, 56°С в течение 1 мин и 72°С. С в течение 1 мин. За этим последовало окончательное удлинение до 72°C в течение 10 мин.

Продукт ПЦР разделяли на 2% агарозном геле, и в качестве стандарта молекулярной массы ДНК использовали лэддер длиной 50 пар оснований.

CAG CAG Ген (128 п.н.)

PCR Усиление с использованием этого грунтовки был проведен с использованием набора грунтовки CAGA-F: 5 -TATAATGCTAATTATHACTAACTGAGGAGCGA-3 и 5 -агаакааааааааааатакгаткатт-3 Ругге и др. (1999). Реакционная смесь объемом 25 мкл состояла из 1 ПЦР-буфера, 1,5 мМ хлорида магния, 200 мкМ каждого dNTP, 20 пмоль каждого праймера и 1 ЕД ДНК-полимеразы Taq (Promega).

Амплификацию проводили в градиенте Eppendorf Mastercycler с использованием следующих параметров циклирования: начальная денатурация при 94°C в течение 5 мин и 40 циклов при 94°C в течение 1 мин, 54°C в течение 1 мин и 72°C в течение 1 мин. мин.За этим последовало окончательное удлинение до 72°C в течение 5 мин. Продукт ПЦР разделяли на 2% агарозном геле, и в качестве стандарта молекулярной массы ДНК использовали лестницу длиной 50 пар оснований.

GLMM Ген (294 BP)

Следующие праймеры использовались: F: 5 -GGATAAGCTTTTAGGGGTGTAGATAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGGGG-3 (738-763) и R: 5 -GCTTTTTTTTTACACTACGCCC-3 (1010–1033) Кансау и др. (1996). Реакционная смесь объемом 25 мкл состояла из 1 ПЦР-буфера, 1,5 мМ хлорида магния, 200 мкМ каждого dNTP, 20 пмоль каждого праймера и 1 ЕД ДНК-полимеразы Taq (Promega).

Условия амплификации: один цикл денатурации при 94°C × 5 мин; 35 циклов при 94°C × 1 мин, отжиг при 56°C × 1 мин и удлинение при 72°C × 2 мин, за которым следует заключительный этап удлинения на 1 цикл при 72°C × 7 мин. 15°С и амплификацию проводили в градиентном циклере Eppendorf Master (Гамбург). Продукт ПЦР разделяли на 2% агарозном геле, и в качестве стандарта молекулярной массы ДНК использовали лестницу длиной 50 пар оснований.

Чувствительность праймеров определяли путем тестирования других бактериальных штаммов родственного рода e.грамм. Salmonella Typhimurium и E . кишечная палочка . Результаты гена glm M сравнивали с золотым стандартом (UBT) с использованием положительных и отрицательных прогностических значений, а также чувствительности и специфичности.

Гены glm M и cag A представляют собой гены, обычно используемые для диагностики H. pylori непосредственно из образцов биопсии, а также изолятов, и поэтому они были адаптированы для использования в ПЦР кала в этом исследовании.

Методы обнаружения Helicobacter pylori в образце стула: современные варианты и разработки

  • Marshall BJ, Warren JR (1984) Неидентифицированные изогнутые бациллы в желудке пациентов с гастритом и пептической язвой. Ланцет (Лондон, Англия) 1 (8390): 1311–1315. https://doi.org/10.1016/s0140-6736(84)91816-6

    CAS Статья Google ученый

  • Wroblewski LE, Peek RM Jr, Wilson KT (2010) Helicobacter pylori и рак желудка: факторы, модулирующие риск заболевания.Clin Microbiol Rev 23(4):713–739. https://doi.org/10.1128/cmr.00011-10

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Камило В., Сугияма Т., Туати Э. (2017) Патогенез инфекции Helicobacter pylori. Helicobacter 22 (приложение): 1. https://doi.org/10.1111/hel.12405

    CAS Статья Google ученый

  • Mitchell H, Katelaris P (2016)Эпидемиология, клинические последствия и текущее клиническое лечение инфекции Helicobacter pylori.Med J Aust 204 (10): 376–380. https://doi.org/10.5694/mja16.00104

    Статья пабмед Google ученый

  • Ke H, Li J, Lu B, Yang C, Wang J, Wang Z, Liu L, Chen Y (2021) Надлежащее пороговое значение рН желудка для эрадикации Helicobacter pylori с помощью квадротерапии на основе висмута. Хеликобактер 26(1):e12768. https://doi.org/10.1111/hel.12768

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Халилпур А., Каземзаде-Нарбат М., Тамайол А., Оклу Р., Хадемхоссейни А. (2016) Биомаркеры и диагностические инструменты для обнаружения Helicobacter pylori.Appl Microbiol Biotechnol 100(11):4723–4734. https://doi.org/10.1007/s00253-016-7495-7

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Халланд М., Хак Р., Лангхорст Дж., Бун Дж. Х., Петри В. А. (2021) Клиническая эффективность анализов H. PYLORI QUIK CHEK™ и H. PYLORI CHEK™, новых тестов на антигены стула для диагностики Helicobacter pylori. Европейский журнал клинической микробиологии и инфекционных заболеваний: официальная публикация Европейского общества клинической микробиологии 40 (5): 1023–1028.https://doi.org/10.1007/s10096-020-04137-7

  • Fang YJ, Chen MJ, Chen CC, Lee JY, Yang TH, Yu CC, Chiu MC, Kuo CC, Weng YJ, Bair MJ , Wu MS, Luo JC, Liou JM (2020)Точность быстрых тестов на антиген Helicobacter pylori для наблюдения за обновленной распространенностью H. pylori на Тайване. J Formosan Med Assoc Taiwan yi zhi 119 (11): 1626–1633. https://doi.org/10.1016/j.jfma.2019.12.003

  • Опекун А.Р., Зьерольд С., Роде А., Блоки Ф.А., Фиорини Г., Сарачино И.М., Вайра Д., Саттон Ф.М. (2020) Клиническая эффективность автоматизированный LIAISON® Meridian H.pylori SA Тест на антиген кала. Международное исследование BioMed 2020: 7189519. https://doi.org/10.1155/2020/7189519

  • Какиути Т., Окуда М., Хашигучи К., Имамура И., Накаяма А., Мацуо М. (2019) Оценка нового набора для экспресс-тестирования антигена стула для обнаружения Helicobacter пилори инфекция. Журнал клинической микробиологии 57 (3). https://doi.org/10.1128/jcm.01825-18

  • Moon HW, Lee SY, Hur M, Yun YM (2018) Характеристики Helicobacter pylori-серопозитивных субъектов согласно результатам теста на антиген в стуле: проспективный изучать.Korean J Intern Med 33 (5): 893–901. https://doi.org/10.3904/kjim.2016.353

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Yan J, Yamaguchi T, Odaka T, Suzuki T, Ohyama N, Hara T, Sudo K, Nakamura K, Denda T, Takiguchi N, Yokosuka O, Nomura F (2010) Анализ стула на антигены является надежным методом обнаружить Helicobacter pylori в остатке желудка после дистальной гастрэктомии по поводу рака желудка. J Clin Gastroenterol 44 (1): 73–74. https://дои.org/10.1097/MCG.0b013e3181aae65e

    Статья пабмед Google ученый

  • Zhou X, Su J, Xu G, Zhang G (2014) Точность теста на антиген стула для диагностики инфекции Helicobacter pylori у детей: метаанализ. Clin Res Hepatol Gastroenterol 38(5):629–638. https://doi.org/10.1016/j.clinre.2014.02.001

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Korkmaz H, Kesli R, Karabagli P, Terzi Y (2013) Сравнение диагностической точности пяти различных тестов на антиген стула для диагностики инфекции Helicobacter pylori.Хеликобактер 18(5):384–391. https://doi.org/10.1111/hel.12053

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Като М., Ота Х., Окуда М., Кикучи С., Сато К., Симояма Т., Судзуки Х., Ханда О., Фурута Т., Мабе К., Мураками К., Сугияма Т., Уэмура Н., Такахаши С. (2019) Руководство по Управление инфекцией Helicobacter pylori в Японии: пересмотренное издание 2016 г. Хеликобактер 24 (4): e12597. https://doi.org/10.1111/hel.12597

  • Lee YC, Tseng PH, Liou JM, Chen MJ, Chen CC, Tu CH, Chiang TH, Chiu HM, Lai CF, Ho JC, Wu MS ( 2014) Проведение одноэтапного теста на основе образцов фекалий для диагностики инфекции Helicobacter pylori в учреждениях первичной медико-санитарной помощи и массового скрининга.Журнал Формозской медицинской ассоциации = Тайвань и чжи 113 (12): 899–907. https://doi.org/10.1016/j.jfma.2012.05.014

  • Ларио С., Рамирес-Ласаро М.Х., Монтсеррат А., Килес М.Е., Хункера Ф., Мартинес-Бауэр Э., Санфелиу И., Брюллет Э., Кампо R, Segura F, Calvet X (2016) Диагностическая точность трех моноклональных тестов кала в большой серии нелеченных пациентов, инфицированных Helicobacter pylori. Clin Biochem 49(9):682–687. https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2016.01.015

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Эль-Шабрави М., Эль-Азиз Н.А., Эль-Адли Т.З., Хассанин Ф., Эскандер А., Абу-Зекри М., Мансур Х., Мешааль С. (2018) Обнаружение антигена в стуле в сравнении с дыхательным тестом на (13)C-мочевину для неинвазивной диагностики инфекции Helicobacter pylori у детей в условиях ограниченных ресурсов.Arch Med Sci: AMS 14 (1): 69–73. https://doi.org/10.5114/aoms.2016.61031

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Кальвет Х, Ларио С., Рамирес-Ласаро М.Х., Монтсеррат А., Кесада М., Ривз Л., Мастерс Х., Суарес-Ламас Д., Галлах М., Микель М., Мартинес-Бауэр Э., Санфелиу И., Сегура Ф. (2010 г. ) Точность моноклональных тестов кала для определения излечения от инфекции Helicobacter pylori после лечения. Хеликобактер 15(3):201–205. https://дои.org/10.1111/j.1523-5378.2010.00757.x

    Статья пабмед Google ученый

  • Пишон М., Пишар Б., Барриоз Т., Плузо К., Кроке В., Фоцинг Г., Шерон А., Вюйемин Э., Вангермез М., Эно П.А., Вассер П., Тибо К., Лефевр К., де Сингли А., Кремнитер Д., Broutin L, Michaud A, Silvain C, Burucoa C (2020) Диагностическая точность неинвазивного теста для обнаружения Helicobacter pylori и устойчивости к кларитромицину в стуле с помощью Amplidiag H.pylori+ClariR ПЦР в реальном времени. Журнал клинической микробиологии 58 (4). https://doi.org/10.1128/jcm.01787-19

  • Редондо Дж. Дж., Келлер П. М., Збинден Р., Вагнер К. (2018) Новая ОТ-ПЦР для обнаружения Helicobacter pylori и идентификации опосредованной резистентности к кларитромицину мутациями в гене 23S рРНК. Diagn Microbiol Infect Dis 90(1):1–6. https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2017.09.014

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Marrero Rolon R, Cunningham SA, Mandrekar JN, Polo ET, Patel R (2021) Клиническая оценка ПЦР в реальном времени для одновременного обнаружения Helicobacter pylori и генотипических маркеров устойчивости к кларитромицину непосредственно из стула.Журнал клинической микробиологии 59 (5). https://doi.org/10.1128/jcm.03040-20

  • Сунь Л., Таларико С., Яо Л., Хе Л., Селф С., Ю И., Чжан Х., Чжан И., Го И., Лю Г., Салама NR, Zhang J (2018) Обнаружение устойчивости к кларитромицину в изолятах Helicobacter pylori на основе капельной цифровой ПЦР выявляет частую гетерорезистентность. Журнал клинической микробиологии 56 (9). https://doi.org/10.1128/jcm.00019-18

  • Бекман Э., Сарачино И., Фиорини Г., Кларк С., Слепнев В., Патель Д., Гомес С., Понака Р., Елагин В., Вайра Д. (2017 ) Новый ПЦР-тест стула на Helicobacter pylori может прогнозировать резистентность к кларитромицину и эрадикацию инфекции с высокой скоростью.J Clin Microbiol 55(8):2400–2405. https://doi.org/10.1128/jcm.00506-17

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Talarico S, Safaeian M, Gonzalez P, Hildesheim A, Herrero R, Porras C, Cortes B, Larson A, Fang FC, Salama NR (2016) Количественное обнаружение и генотипирование Helicobacter pylori из стула с использованием капельной цифровой ПЦР показывает изменение бактериальной нагрузки, которое коррелирует с носительством гена вирулентности cagA.Хеликобактер 21(4):325–333. https://doi.org/10.1111/hel.12289

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Beer-Davidson G, Hindiyeh M, Muhsen K (2018) Обнаружение Helicobacter pylori в образцах стула маленьких детей с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени. Хеликобактер 23 (1). https://doi.org/10.1111/hel.12450

  • Sicinschi LA, Correa P, Bravo LE, Peek RM Jr, Wilson KT, Loh JT, Yepez MC, Gold BD, Thompson DT, Cover TL, Schneider BG (2012)Неинвазивное генотипирование Helicobacter pylori cagA, vacA и hopQ у бессимптомных детей.Хеликобактер 17(2):96–106. https://doi.org/10.1111/j.1523-5378.2011.00919.x

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Scaletsky IC, Aranda KR, Garcia GT, Gonçalves ME, Cardoso SR, Iriya K, Silva NP (2011) Применение ПЦР-анализа стула в реальном времени для обнаружения Helicobacter pylori и тестирования чувствительности к кларитромицину у бразильских детей. Хеликобактер 16(4):311–315. https://doi.org/10.1111/j.1523-5378.2011.00845.x

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Мишра С., Сингх В., Рао Г.Р., Диксит В.К., Гулати А.К., Натх Г. (2008) Распространенность Helicobacter pylori у бессимптомных субъектов – исследование на основе вложенной ПЦР. Инфекция, генетика и эволюция: журнал молекулярной эпидемиологии и эволюционной генетики инфекционных заболеваний 8 (6): 815-819. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2008.08.001

  • Leonardi M, La Marca G, Pajola B, Perandin F, Ligozzi M, Pomari E (2020) Оценка ПЦР в реальном времени на Helicobacter pylori в кале при коинфекции кишечными паразитами: сравнительное исследование методов выделения ДНК.ВМС Микробиол 20(1):131. https://doi.org/10.1186/s12866-020-01824-5

    CAS Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Кадходаи С., Сиавоши Ф., Акбари Ногаби К. (2020) Мукоидный и коккоидный Helicobacter pylori с быстрым ростом и устойчивостью к антибиотикам. Хеликобактер 25(2):e12678. https://doi.org/10.1111/hel.12678

    Статья пабмед Google ученый

  • Leal YA, Cedillo-Rivera R, Simon JA, Velázquez JR, Flores LL, Torres J (2011) Полезность тестов на основе образцов стула для диагностики инфекции Helicobacter pylori у детей.J Pediatr Gastroenterol Nutr 52 (6): 718–728. https://doi.org/10.1097/MPG.0b013e3182077d33

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Giorgio F, Ierardi E, Sorrentino C, Principi M, Barone M, Losurdo G, Iannone A, Giangaspero A, Monno R, Di Leo A (2016) Выделение ДНК Helicobacter pylori в стуле: обязательное условие для бактериального неинвазивного молекулярного анализа. Scand J Gastroenterol 51(12):1429–1432. https://дои.org/10.1080/00365521.2016.1216592

    Статья пабмед Google ученый

  • Ali MM, Wolfe M, Tram K, Gu J, Filipe CDM, Li Y, Brennan JD (2019) Колориметрический бумажный датчик на основе ДНКазима для обнаружения Helicobacter pylori. Angew Chem Int Ed Engl 58 (29): 9907–9911. https://doi.org/10.1002/anie.2013

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Chen L, Li X, Zou T, Wang T, Cui X, Chen Y, Zhang C, Zhao S (2019) Сверхчувствительное обнаружение H.pylori в фекалиях человека на основе захвата иммуномагнитных шариков и флуоресцентных квантовых точек. Аналитик 144 (13): 4086–4092. https://doi.org/10.1039/c9an00193j

  • Jain U, Gupta S, Soni S, Khurana MP, Chauhan N (2020) Неинвазивное электроиммунное определение токсина CagA на основе тройного наноструктурирования для обнаружения Helicobacter pylori. Хеликобактер 25(4):e12706. https://doi.org/10.1111/hel.12706

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Ding Z, Zhao S, Gong S, Li Z, Mao M, Xu X, Zhou L (2015) Распространенность и факторы риска инфекции Helicobacter pylori у бессимптомных китайских детей: проспективный, перекрестный, популяционный изучать.Aliment Pharmacol Ther 42 (8): 1019–1026. https://doi.org/10.1111/apt.13364

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Shimoyama T, Oyama T, Matsuzaka M, Danjo K, Nakaji S, Fukuda S (2009) Сравнение теста на антиген стула и серологии для диагностики инфекции Helicobacter pylori при массовом обследовании. Хеликобактер 14(2):87–90. https://doi.org/10.1111/j.1523-5378.2009.00672.x

    CAS Статья пабмед Google ученый

  • Shimoyama T (2013) Анализы стула на антигены для лечения инфекции Helicobacter pylori.World J Gastroenterol 19 (45): 8188–8191. https://doi.org/10.3748/wjg.v19.i45.8188

    Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Кодама М., Мураками К., Окимото Т., Фукуда Й., Шимояма Т., Окуда М., Като С., Кобаяши И., Фудзиока Т. (2012) Влияние лечения ингибитором протонной помпы на анализ антигена в стуле Helicobacter pylori. World J Gastroenterol 18 (1): 44–48. https://doi.org/10.3748/wjg.v18.i1.44

    Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Шелигова Б., Лукач Л., Бабелова М., Ваврова С., Суло П. (2020) Диагностическая надежность вложенной ПЦР зависит от дизайна праймера и пороговой численности Helicobacter pylori в образцах биопсии, стула и слюны.Хеликобактер 25(2):e12680. https://doi.org/10.1111/hel.12680

    Статья пабмед Google ученый

  • Wongphutorn P, Chomvarin C, Sripa B, Namwat W, Faksri K (2018) Обнаружение и генотипирование Helicobacter pylori в образцах слюны и стула бессимптомных лиц в Северо-Восточном Таиланде позволяет выявить внутрихозяинные тканеспецифические подтипы H. pylori. BMC Microbiology 18 (1): 10. https://doi.org/10.1186/s12866-018-1150-7

  • Lottspeich C, Schwarzer A, Panthel K, Koletzko S, Rüssmann H (2007) Оценка нового метода ПЦР в реальном времени Helicobacter pylori ClariRes для выявления и определения чувствительности к кларитромицину H.pylori в образцах стула у детей с симптомами. J Clin Microbiol 45 (6): 1718–1722. https://doi.org/10.1128/jcm.00103-07

  • ПЦР-выявление чувствительных и резистентных к кларитромицину Helicobacter pylori из фиксированных формалином и залитых парафином биоптатов желудка

    В нескольких предыдущих отчетах описывалась идентификация кларитромицина -резистентный H. pylori с помощью ПЦР из клинических образцов с использованием культур, выращенных из биоптатов желудка 12, 18, 19 , а в последнее время из фиксированной формалином и залитой в парафин ткани биопсии желудка. 20

    Использование ПЦР для выявления резистентных к кларитромицину H. pylori в фиксированных формалином и залитых парафином тканях дает несколько потенциальных преимуществ по сравнению с культуральными методами. Поскольку тестирование можно проводить на ткани, залитой в парафин, можно избежать особых условий и временных ограничений для транспортировки. Использование фиксированных формалином тканей, залитых парафином, также позволяет принимать решение о тестировании после микроскопической интерпретации патологоанатомом.Затем можно взять наиболее подходящие срезы для ПЦР-тестирования, сводя к минимуму ошибку отбора проб, которая может возникнуть при использовании культуральных методов. Предварительное микроскопическое исследование тканей также может выявить отсутствие изменений, характерных для инфекции H. pylori , что полностью исключает необходимость дальнейшего тестирования. Присутствие H. pylori в биоптатах желудка и статус резистентности к кларитромицину можно оценить одновременно, определяя правильное лечение во время постановки диагноза.Наконец, ПЦР можно использовать ретроспективно на ранее полученных образцах, чтобы оценить, могла ли резистентность к кларитромицину быть фактором неэффективности лечения.

    Это исследование предполагает, что чувствительность ПЦР может быть ниже, чем у методов, основанных на иммуногистохимии, для обнаружения H. pylori в фиксированных формалином и залитых парафином образцах биопсии желудка, обнаруживая 84% случаев, выявленных с помощью иммуногистохимии. Тщательный отбор парафиновых срезов, представляемых для ПЦР-тестирования, а также оптимальный контроль времени фиксации формалином должны способствовать дальнейшему смягчению любых различий в чувствительности.Иммуногистохимия предлагает подходящий метод для первоначального предполагаемого диагноза инфекции H. pylori , особенно в случаях, когда присутствует небольшое количество бактерий; однако последующий положительный анализ ПЦР может быть использован для подтверждения инфекции H. pylori , в дополнение к получению ценной информации о чувствительности к кларитромицину. Также следует отметить тот факт, что с помощью ПЦР удалось обнаружить ДНК H. pylori в 2 (из 24) случаях, демонстрирующих отрицательное иммуногистохимическое окрашивание.Эти данные свидетельствуют о том, что использование ПЦР может быть полезным в некоторых случаях, когда подозрение на инфекцию H. pylori сохраняется, несмотря на отрицательное иммуногистохимическое окрашивание.

    Самые последние данные, полученные в рамках Программы мониторинга устойчивости к противомикробным препаратам (HARP) Helicobacter pylori , показали, что общий уровень устойчивости к кларитромицину среди населения Соединенных Штатов составляет 12,9%. 21 В целом почти у половины пациентов в нашем исследовании (50%) были обнаружены мутации, связанные с устойчивостью к кларитромицину.Хотя этот высокий процент поразителен по сравнению с исследованием HARP, важно отметить, что пациенты в нашей исследуемой популяции обычно обращаются за биопсией после предполагаемой неудачи начальной терапии. Известно, что распространенность устойчивых к противомикробным препаратам H. pylori значительно варьируется в зависимости от региона во всем мире, включая различные регионы Соединенных Штатов, и, как было показано, имеет сильную корреляцию с региональной практикой применения противомикробных препаратов. 22, 23 Будущие исследования, включая корреляцию с историей болезни, будут полезны для выяснения процента пациентов, обращающихся за биопсией, после неэффективности терапии, включающей кларитромициновый компонент.

    В этом исследовании кривые плавления были неразличимы между двумя наблюдаемыми мутациями (данные не показаны). Предыдущие исследования показали, что наличие мутации A2143G значительно снижает потенциал эрадикации H. pylori при использовании схем, содержащих кларитромицин, в большей степени, чем наличие мутаций A2142C или A2142G. 24 В настоящее время клинические проявления и современные методы лечения для каждого из них идентичны, и нет возможности дифференцировать штаммы в условиях клинической лаборатории.Однако дифференциация мутаций может иметь значение в будущих эпидемиологических исследованиях или при изменении рекомендаций по антимикробной терапии.

    Количество известных положительных штаммов H. pylori , включенных в это исследование, ограничено, и поскольку это было ретроспективное исследование с использованием фиксированных формалином тканей, корреляцию с бактериальной культурой нельзя было провести с использованием образцов пациентов. Фенотипические данные об устойчивости к кларитромицину с помощью Е-теста продемонстрировали 100% совпадение с результатами ПЦР с использованием предоставленного штамма H.pylori штаммов. Хотя мы подозреваем, что наши результаты будут в значительной степени согласовываться, проспективная клиническая проверка была бы полезна с использованием бактериальных культур, полученных из свежей биопсийной ткани, полученной эндоскопией, например, полученной для экспресс-теста на уреазу. Сравнение с одновременно полученной биопсийной тканью, фиксированной формалином и залитой парафином, было бы полезно для определения истинной чувствительности и специфичности анализа в клинических условиях.

    Следует отметить, что в исследуемой популяции мутаций A2142C не наблюдалось.Хотя наши эталонные штаммы не включали образец с мутацией A2142C, ранее было показано, что кривая плавления легко отличима от немутированных штаммов и от любой из мутаций от A до G. 12 Этот результат не удивителен, так как мутации A2142C встречаются значительно реже и, вероятно, могли отсутствовать в этой конкретной исследуемой популяции. 25

    Таким образом, мы описали использование ПЦР в реальном времени на платформе LightCycler для быстрого обнаружения H.pylori , и оценка статуса чувствительности к кларитромицину непосредственно из фиксированных формалином и залитых в парафин образцов биопсии желудка с использованием комбинации зонда и праймера, впервые описанной Oleastro et al. 12 в 2003 году. Отсутствие амплификации гена 23S было минимально проблематичным и, вероятно, из-за чрезмерной фиксации формалином или ошибки отбора проб при обнаружении небольшого количества организмов. Использование праймеров для ПЦР, амплифицирующих ДНК-мишень меньшего размера, или использование нефиксированных образцов может дать большее количество образцов с интерпретируемыми результатами.

    Внедрение этого метода в клиническую лабораторию позволит идентифицировать H. pylori и оценить резистентность к кларитромицину в предварительно фиксированных образцах биопсии желудка менее чем за 4 часа анализа. Этот метод может заменить трудоемкий процесс посева и определения чувствительности к противомикробным препаратам. Это также позволит оценить образцы, фиксированные формалином, в тех случаях, когда посев не проводился, либо потому, что он не проводится рутинно в микробиологической лаборатории, либо из-за непредвиденных обстоятельств H.pylori -ассоциированный гастрит выявляется при гистологическом исследовании. Быстрые средства выявления резистентных к кларитромицину штаммов H. pylori непосредственно из образцов пациентов потенциально могут оказать существенное влияние на клиническое ведение гастрита, ассоциированного с H. pylori , позволяя своевременно оценить статус резистентности к кларитромицину, что приведет к снижению частота неудач лечения.

    Применение ПЦР-теста кала для диагностики инфекции Helicobacter pylori у детей | Интернет-исследования в области здравоохранения и окружающей среды (HERO)

    Цель: Оценить полезность теста ПЦР кала для диагностики инфекции Helicobacter pylori (H. pylori) у детей.

    МЕТОДЫ: На основании эндоскопических признаков (включая узловой гастрит, эрозивный дуоденит и язву) и/или положительного экспресс-теста с уреазой (RUT), полученного во время эндоскопии, 28 детей из группы детей, госпитализированных в Детский медицинский центр Тегерана для постоянные проблемы с верхним желудочно-кишечным трактом были выбраны для сравнения тестов на основе биопсии с ПЦР кала. Их желудочная активность и бактериальная плотность оценивались по обновленной Сиднейской системе, а их первый стул после эндоскопии хранился при температуре -70 градусов по Цельсию.Биопсии культивировали на чашках с модифицированным кровяным агаром и идентифицировали окрашиванием по Граму, биохимическими тестами и ПЦР. Для выделения ДНК из изолятов H. pylori использовали два метода: фенол-хлороформ и кипячение. Выделение ДНК из стула проводили с помощью набора для выделения ДНК из стула (Bioneer Inc, Корея). ПЦР проводили с использованием праймеров для обнаружения генов vacA, cagA и 16srRNA как в изолятах, так и в кале.

    РЕЗУЛЬТАТЫ: Шестнадцать из 28 детей-пациентов (57%) были классифицированы как положительные на H. pylori по результатам биопсийных тестов, из которых 11 (39%) также были положительными по результатам ПЦР кала.Чувствительность и специфичность ПЦР кала составила 62,5% и 92,3% соответственно. H. pylori наблюдали в гистологических срезах у 10 из 11 пациентов с положительным калом. Наблюдалась ассоциация между более высоким баллом H. pylori в гистологическом исследовании и положительным результатом ПЦР кала. Также наблюдалась ассоциация между более тяжелой формой гастрита и положительной ПЦР кала.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.