Рђ. Р”. РўСЏРїРєРёРЅР°
РџСЂРё действии РЅР° организм экстремальных факторов, Рє числу которых относится переохлаждение, РїСЂРѕРёСЃС…РѕРґСЏС‚ изменения гомеостатических констант (прежде всего относящихся Рє системе РєСЂРѕРІРё). Белые клетки РєСЂРѕРІРё, имея высокую реактивность, быстро включаются РІ адаптационные реакции [3]. РћРЅРё СЃРїРѕСЃРѕР±РЅС‹ Рє неспецифическому реагированию РІ ответ РЅР° альтерирующие воздействия. Переохлаждение организма может быть вызвано внешними РЅРёР·РєРёРјРё температурами Рё фармакологическими агентами, способными снижать температуру тела. Рто, главным образом, вещества, оказывающие наркотический эффект. Рљ РёС… числу относится этиловый алкоголь, способный воспроизводить РІСЃРµ характерные черты влияния неингаляционных наркотиков РЅР° теплорегуляцию [5].
Рзменение функциональной активности лейкоцитов РїСЂРё охлаждении организма, являясь сложной медико-биологической Рё клинической проблемой, изучено недостаточно. Целью нашего исследования была оценка некоторых функциональных свойств белых клеток РєСЂРѕРІРё РїСЂРё экзогенном охлаждении организма Рё гипотермии, вызванной РЅРёР·РєРѕР№ температурой окружающей среды РІ сочетании СЃ действием этилового спирта.
Материал и методы исследования
Опыты проведены на 30 белых крысах - самцах, поделённых на 3 группы: контрольная (I), гипотермия (II), гипотермия + алкоголь (III). Животных II группы охлаждали в воде при температуре 15°С до появления признаков "холодового наркоза". Животным III группы за 20 мин. до охлаждения вводили через желудочный зонд 30%-ный раствор этилового спирта (1мл/100г).
Смешанную кровь для исследований брали путём декапитации у предварительно наркотизированных животных. Гепаринизированную кровь (10ед/мл) центрифугировали 10мин. при 1500 об/мин. Собирали лейкоциты, а примесь эритроцитов разрушали 0,83% раствором хлорида аммония. Клетки дважды отмывали изотоническим буферным раствором. Отмытые клетки ресуспендировали и определяли их концентрацию путём подсчёта в камере Горяева.
Фагоцитоз
Для исследования поглотительной способности нейтрофилов использовали частицы латекса размером 0,8мкм. Смесь лейкоцитов с латексом выдерживали во влажной камере при 37°С в течение 30 мин. при постепенном, легком взбалтывании. Затем готовили мазки, фиксировали 5 мин. в метаноле и окрашивали азур-II-эозином. Поглотительную способность нейтрофилов оценивали по числу фагоцитирующих клеток (фагоцитарная активность) и среднему числу поглощённых частиц (фагоцитарный индекс) [6].
Миграционная активность
Для постановки миграции под агарозой использовали модифицированный вариант, описанный в многочисленных работах [4,8]. Агарозу с добавлением культуральной клеточной среды 199 наслаивали на предметные стёкла. Для оценки спонтанной миграции в агаровом геле с помощью пробойника вырезали одну лунку, в которую помещали суспензию лейкоцитов. На втором стекле ставили реакцию индуцированной миграции. Для этого вырезали группу из двух лунок: одну - для клеточной суспензии, вторую - для хемоаттрактанта, в качестве которого использовали свежую плазму крови. Стёкла помещали во влажную камеру при 37°С на 2 ч., затем погружали в 2%-ный раствор глутарового альдегида на 60 мин. после фиксации и удаления агарозы, клетки окрашивали азур-эозином по Романовскому. В обоих случаях для оценки локомоционной активности измеряли площадь распространения клеток и рассчитывали хемотаксический дифференциал - отношение изменений площади индуцированной миграции по сравнению со спонтанной к площади клеточного ареала при самопроизвольной миграции (%).
Адгезионная способность
40 РјРєРј суспензии лейкоцитов помещали РІ капилляр СЃ внутренним диаметром 0,56 РјРј, предварительно обработанный аутоплазмой. Клетки инкубировали РІРѕ влажной камере РїСЂРё 37°С РІ течение 60 РјРёРЅ. Затем капилляр перфузировали раствором Дульбекко РїСЂРё напряжении СЃРґРІРёРіР° 0,1 Рќ/Рј2 Рё повторно - 30 Рќ/Рј2. Считали число клеток РІ РёСЃС…РѕРґРЅРѕР№ суспензии, Р° также первом (неадгезировавшие Рё СЃ малой силой сцепления) Рё втором (СЃРѕ средней силой сцепления) смыве. РР· полученных данных рассчитывали число клеток, оставшихся РІ капилляре (СЃ большой силой сцепления) [9].
Механические свойства лейкоцитов
В основу эксперимента была положена методика Tran-Son-Tay R. с соавт. [11]. Вытягивали капилляры диаметром 4 мкм, помещали их в микрокамеру и соединяли с манометром. Вся система заполнялась изоосмотическим буфером. Перемещение клеток в капилляре и к капилляру обеспечивалось постоянным во всех опытах отрицательным давлением (60 мм вод. ст.). Все манипуляции проводили на предметном столике микроскопа. Для наблюдений и замеров использовали объектив 40 ВРи окуляр-микрометр МОВ-1-15*. Регистрировали для каждой клетки первичные параметры (диаметр лейкоцита в исходном состоянии, длину и ширину деформированной клетки, время восстановления до сферической формы).
Осмотическая резистентность
Определение осмотической стойкости лейкоцитов проводили классическим способом по методу Сторти [10], подсчитывая процент клеток, сохранившихся после часовой экспозиции в 0,2% растворе хлорида натрия.
Результаты исследований и их обсуждение
В качестве фактора охлаждения была выбрана вода температуры 15°С, т.к. переохлаждение в водной среде по сравнению с воздушной (той же температуры) наступает в несколько раз быстрее [2].
Критерием сопротивляемости белых крыс к максимальному охлаждению служило время до появления признаков "холодового наркоза" после погружения животных в воду. Наступление "холодового наркоза" определялось замедлением, а затем и нарушением координации плавательных движений, появлением тонических судорог и погружением на дно аквариума. По ходу исследования было отмечено следующее.
Для крыс II РіСЂСѓРїРїС‹ была характерна двигательная активность РІ РІРёРґРµ плавательных движений. Время РґРѕ появления признаков "холодового наркоза" составляло РІ среднем 17 РјРёРЅ. Большая часть животных III РіСЂСѓРїРїС‹ была малоподвижна, РЅРѕ признаки "холодового наркоза" регистрировались РІ среднем через 23 РјРёРЅ. Рзменения ректальной температуры Сѓ животных II РіСЂСѓРїРїС‹ составили РІ среднем 14°С, Сѓ животных III РіСЂСѓРїРїС‹ - 11°С. РџРѕ данным литературы [2], такое снижение температуры характеризует среднюю степень гипотермии.
На основе полученных в эксперименте данных был сделан анализ изменений активных и пассивных свойств лейкоцитов в условиях переохлаждения организма, в том числе после введения этилового спирта. Анализ изменений поглотительной способности нейтрофилов в условиях гипотермии выявил незначительное снижение фагоцитарной активности (1%) с одновременным увеличением числа поглощенных частиц (19%). Охлаждение в условиях алкогольной интоксикации негативно сказывалось на функциональной активности нейтрофилов: снижались оба показателя (ФА-10%, ФР-17%) (табл. 1).
Таблица 1
Показатели поглотительной способности нейтрофилов
Группа животных | Фагоцитарная активность (%) | Фагоцитарный индекс (отн. ед.) |
I РіСЂСѓРїРїР° | 92,8 В± 1,01 | 9,3 В± 0,3 |
II РіСЂСѓРїРїР° | 91,5 В± 1,03 | 11,1 В± 0,46* |
III РіСЂСѓРїРїР° | 84,1 В± 1,28*, ** | 8,0 В± 0,49*, ** |
Примечание: * - достоверность различий по сравнению с контролем (р
** - достоверность различий по сравнению с переохлаждением (р
Выявленные изменения поглотительной способности относятся к неспецифическим реакциям защиты фагоцитирующих клеток, т.к. частицы латекса, используемые нами в опытах, не являются антигенными и могут поглощаться нейтрофилами при отсутствии опсонинов.
Нейтрофилы выполняют фагоцитарную функцию как в крови, так и за пределами кровеносного русла. Для осуществления данной функции клетки должны путём черезэндотелиальной миграции покинуть кровоток. Часть из них медленно движется вдоль сосудистой стенки и иногда адгезируется к ней. Другая часть мигрирует через эндотелий. Таким образом, адгезия нейтрофилов является необходимой в процессе черезэндотелиального транспорта и фагоцитоза.
Проведённое исследование выявило следующие особенности адгезионной способности лейкоцитов в экстремальных условиях (табл. 2).
Таблица 2
Адгезионная способность нейтрофилов
Группа животных | Неадгезировавшие клетки (%) | Клетки со средней степенью сцепления (%) | Клетки с большой силой сцепления (%) |
I РіСЂСѓРїРїР° | 32,2 В± 4,62 | 11,5 В± 2,12 | 56,1 В± 6,15 |
II РіСЂСѓРїРїР° | 50,3 В± 3,89* | 10,6 В± 0,87 | 39,1 В± 4,35* |
III РіСЂСѓРїРїР° | 29,3 В± 3,9** | 13,1 В± 1,94 | 57,6 В± 5,7** |
Примечание: * - достоверность различий по сравнению с контролем (р
** - достоверность различий по сравнению с переохлаждением (р
При охлаждении животных адгезионная способность лейкоцитов достоверно снижалась (56%), преимущественно за счёт клеток с большой силой сцепления. Сочетание охлаждения с введением алкоголя приводило к возвращению числа адгезировавших клеток к уровню контрольных животных. Стабилизирующий эффект в данном случае связан, скорее всего, с гуморальными сдвигами, опосредуемыми этиловым спиртом. Если сравнить динамику показателей III группы животных с показателями II группы, то можно отметить резкое снижение числа неадгезировавших клеток (42%) и, одновременно, увеличение числа клеток с большой силой сцепления (33%) и клеток со средней силой сцепления (19%).
Вероятно, этиловый спирт влияет на биоэнергетические процессы, затрагивающие и белые клетки крови.
При оценке адгезионной способности должны учитываться два рода явлений: 1) прочность физического контакта между клетками и матриксом; 2) распластывание лейкоцитов на подложке, что затрудняет их удаление с субстрата [7]. Для того, чтобы выяснить влияние данных процессов на изменение неспецифической адгезии, необходимо рассмотреть динамику миграционной активности.
Таблица 3
Показатели миграционной активности лейкоцитов
Группа животных | Площадь распространения клеток при спонтанной миграции (мм2) | Площадь распространения клеток при индуцированной миграции (мм2) | Хемотаксический дифференциал (%) |
I РіСЂСѓРїРїР° | 4,2 В± 0,22 | 4,2 В± 0,35 | 9,1 В± 6,64 |
II РіСЂСѓРїРїР° | 4,6 В± 0,18 | 4,6 В± 0,26 | 4,5 В±10,19 |
III РіСЂСѓРїРїР° | 4,7 В± 0,29 | 5,6 В± 0,25*, ** | 22,8 В± 7,42 |
Примечание: * - достоверность различий по сравнению с контролем (р
** - достоверность различий по сравнению с переохлаждением (р
Анализ результатов показал, что при охлаждении животных до признаков "холодового наркоза" миграционные реакции нейтрофилов не отличались от контроля. Сочетание охлаждения с дачей алкоголя приводило к повышению хемокинетической активности. У животных I и II групп хемотаксическое действие не вызвало изменения площади миграции. У III группы животных хемотаксическое действие вызывало достоверный прирост площади миграции с 4,7 ± 0,29 мм2 до 5,6 ± 0,25 мм2. Следовательно, охлаждение организма не влияет на миграционную активность лейкоцитов, а активизирующий эффект, вызванный приёмом умеренных доз алкоголя до начала охлаждения, связан, скорее всего, с гуморальными сдвигами, опосредуемыми этиловым спиртом.
При оценке механических свойств лейкоцитов использовали время восстановления деформированной клетки до сферической формы. Полученные данные говорят о том, что после переохлаждения организма время восстановления увеличилось с 2,5 ± 0,44 мин. до 2,8 ± 0,38 мин. (р
Возможно, это происходит потому, что охлаждение отрицательно воздействует на эластичность мембран клеток [1], а этиловый спирт оказывает стабилизирующий эффект за счёт своего влияния на биоэнергетические процессы в клетке [5].
Осмотическая стойкость лейкоцитов при переохлаждении организма снизилась на 13,7% (контроль - 48,8 ± 5,17; переохлаждение - 35,1 ± 5,13, р
Рсследований РїРѕ морфофункциональным перестройкам клеток РІ условиях общей экзогенной гипотермии нам РЅРµ встретилось.РџРѕ данным [1], локальное охлаждение вызывает разрушение мембран клеток Рё деструкцию клеточных органелл. Образующиеся РїСЂРё этом соединения обладают иммуносупрессорными свойствами Рё поэтому являются РѕРґРЅРѕР№ РёР· причин угнетения иммунологической реактивности организма, наблюдающегося РїСЂРё локальном действии РЅРёР·РєРёС… температур.Проведённое исследование показало, что РїСЂРё острой гипотермии РїСЂРѕРёСЃС…РѕРґСЏС‚ неоднозначные изменения физиологических реакций лейкоцитов, проявляющиеся РІ снижении адгезионных свойств РїСЂРё увеличении поглотительной способности Рё стабильности миграционных реакций нейтрофилов. Сочетание охлаждения СЃ дачей алкоголя РІ большинстве случаев вызывает повышение функциональной активности лейкоцитов РєСЂРѕРІРё, что, РїРѕ-РІРёРґРёРјРѕРјСѓ, связано СЃ его специфическим воздействием РЅР° обмен веществ.
Список литературы
Авакян Рђ.Р . Рммуномодулирующее действие ферментов РїСЂРё локальном охлаждении // Тезисы докладов V Р РѕСЃСЃРёР№СЃРєРѕРіРѕ национального конгресса: Человек Рё лекарство. Рњ., 1998. РЎ. 429 - 429.
Баженов Р®.Р. Термогенез Рё мышечная деятельность РїСЂРё адаптации Рє холоду. Р›.: Наука, 1981. РЎ. 7-11.
Горизонтов Рџ.Р”., Белоусова Рћ.Р., Федотова Рњ.Р. Стресс Рё система РєСЂРѕРІРё. Рњ.: Медицина, 1883. РЎ. 57 - 57.
Дугласс РЎ.Р”., РљСѓРё Рџ.Р“. Рсследование фагоцитоза РІ клинической практике. Рњ.: Медицина, 1983.
Воспроизведение заболеваний у животных для экспериментально-терапевтических исследований / Под ред. Н.В. Лазарева. Л.: Медгиз, 1954. С. 115-117.
Потапова РЎ.Р“., Хрустиков Р’.РЎ., Демидова Рќ.Р’., Козинец Р“.Р. Рзучение поглотительной способности нейтрофилов РєСЂРѕРІРё СЃ использованием инертных частиц латекса // Проблемы гематологии Рё переливания РєСЂРѕРІРё. 1977. в„– 9. РЎ. 58-59.
Редчиц Е.Г., Гузеева О.В. Адгезия нейтрофилов: патогенетические и методические аспекты // Лаб. дело. 1991. № 5. С. 4-8.
Соколова Рў.Р¤., Редькин Р®.Р’. Рзучение спонтанной миграционной активности лейкоцитов РїРѕРґ агаровым покрытием // Лаб. дело. 1983. в„– 1. РЎ. 31-33.
Mege Y., Eon B., Saux P. et al. Inhibition of Granulocyte Adhesion by Pentoxifylline and Analogues: Effects of Leukocyte function // Proceedings of the Workshop. - France, Saint Paul-de-Vence, 1989. P. 17-23.
Storti E. Pederzini A. Augmentation de la resistance des globules blancs par Padministration de stiblene // Schweiz, Med. Wochenschr. 1955. V 85. P.38-39
Tran- Son- Tay R., Needham D., Yeung A., Hochmuth R.M. Timedependent recovery of passive neutrophils after large deformation // Biophys. J.Biophysical Society.1991. P. 856-866.
Для подготовки данной работы были использованы материалы с сайта http://www.yspu.yar.ru