До начала 1980-х лимфома желудка классифицировалась в соответствии с эндоскопической классификацией, предложенной Палмером в 1950 году. ¹ В то время лимфомы, которые патологоанатомы могли исследовать, были, по большей части, большими развитыми опухолями с инфильтрацией всех слоев стенки желудка, инфильтрацией соседних тканей и поражением регионарных лимфатических узлов.

Лимфомы, обнаруженные в биопсийном материале, часто ошибочно диагностировались как карциномы, и для дальнейшей диагностики часто рекомендовали резекцию желудка. Гистологическая классификация была просто и недифференцированной: «лимфосаркома».

Три вехи в 1983 и 1984 годах ознаменовали конец этого неудовлетворительного состояния и начало положительного развития. Исааксон и Райт разработали MALT-концепцию лимфомы желудка, ² Уоррен и Маршалл описали H. pylori , ³ и из Японии пришли – по аналогии с ранними карциномами – первые сообщения о ранних лимфомах желудка с ограничением инфильтрации до слизистая и подслизистая. ⁴ В последующие годы процент ранних лимфом среди лимфом желудка быстро увеличивался.Цифра для материалов из Вены за период 1974–78 гг. Составляла 21,7%, ⁵ в Токио между 1977 и 1986 гг., 40,9%, ⁶ и в нашем собственном материале между 1983 и 1989 гг., 49,6%.

На момент постановки диагноза ранние лимфомы желудка уже имеют относительно большой диаметр, не отличающийся от диаметра прогрессирующих лимфом. ⁷ Их можно распознать макроскопически по ряду совпадающих данных – утолщенным складкам, эрозиям и изъязвлениям. ^{2, 8} Как и в случае ранней карциномы желудка, эти поражения подвергаются злокачественному циклу, ⁹ заживают и снова появляются, в результате чего видна разнообразная картина, включая утолщенные складки, эрозии, язвы, шрамы и регенеративную слизистую оболочку. .

Тот факт, что ранние лимфомы уже имеют относительно большой диаметр – в среднем около 8 см – на момент постановки диагноза, мог побудить нас подозревать, что на поверхности слизистой оболочки должен присутствовать фактор, стимулирующий рост.

Распознавание ранней лимфомы было шагом вперед, о чем свидетельствуют следующие данные: глубина инфильтрации коррелирует с поражением регионарных лимфатических узлов и степенью злокачественности опухоли ¹⁰ ; чем глубже инфильтрация, тем больше случаев поражения лимфатических узлов и тем больше случаев злокачественных новообразований высокой степени. Поэтому логичен тот факт, что глубина инфильтрации является основным прогностическим фактором в случаях лимфомы желудка. ¹¹

Достижения в ранней эндоскопически-биоптической диагностике также отражаются в изменении относительных пропорций лимфом низкой и высокой степени злокачественности. В то время как ранее преобладание диагностированных лимфом было высокой степени злокачественности, ¹² в 1990-е годы был обнаружен более высокий процент лимфом низкой степени злокачественности – процент лимфом низкой степени злокачественности в нашем материале от 351 пациента в период 1993–1998 годов составлял 77,2. %.

В конце 1980-х годов Исааксон и его коллеги предложили первую хорошую гистологическую классификацию. ¹³ Поскольку местом происхождения опухоли является перифолликулярная маргинальная клетка, в пересмотренной европейско-американской классификации лимфоидных новообразований ¹⁴ и в новой классификации опухолей пищеварительной системы ВОЗ ¹⁵ лимфома также называется лимфомой. маргинальная В-клеточная лимфома. Первичные Т-клеточные лимфомы желудка встречаются очень редко. Из 220 хирургических образцов лимфомы желудка только два были Т-клеточными лимфомами. ¹⁰

Решающим достижением в диагностике злокачественных лимфом желудка низкой степени злокачественности на основе биопсии стало установление следующих гистологических критериев Исааксоном и его коллегами ^{16, 17} :

1. Замена желудочных желез однородными инфильтратами, содержащими центроцитоидные клетки (см. рис 3)

2. Явное свидетельство лимфоидной деструкции желудочных желез фовеол (рис. 1 и 2).

Частичное разрушение желудочной железы инфильтратами MALT-лимфомы низкой степени злокачественности (иммуногистохимия с антителом к ​​CD 20).

Множественные поражения лимфоэпителием при лимфоме низкой степени злокачественности MALT (иммуногистохимия с использованием антител к панцитокератину).

Диагноз MALT лимфомы желудка низкой степени злокачественности следует ставить только в том случае, если доказан инвазивный и деструктивный рост опухоли.То есть, когда ямки и / или железы частично или почти полностью разрушаются лимфоидными клетками.

Для точного гистологического диагноза лимфомы желудка MALT после первой диагностической работы часто необходимо провести проблемно-ориентированное эндоскопически-биоптическое исследование с дополнительной целью обнаружения возможной фокальной трансформации в лимфому высокой степени злокачественности. Для такого исследования необходимо получить не менее 15 образцов биопсии из любого эндоскопически подозрительного поражения. ¹⁸

ОТКРЫТИЕ СВЯЗИ МЕЖДУ

Пути исследования H pylori и желудочного MALT-лимфомы впервые пересеклись в 1988 году с признанием того, что причиной приобретенного желудочного MALT является хроническая инфекция, вызванная H pylori . ^{19, 20} Первым фрагментом головоломки, который помог прояснить эту связь, было эпидемиологическое исследование, которое показало зависимость заболеваемости MALT-лимфомой от частоты инфицирования H. pylori . ²¹ Вторая причина заключалась в том, что ранние лимфомы, как приобретенный MALT, локализуются в основном в антральном отделе желудка. ⁷

Анализ хирургических образцов лимфомы желудка MALT показал гастрит H. pylori в 92,0–98,3%. ^{10, 22} Кроме того, исследование случай-контроль, проведенное Parsonnet и соавторами ²³ , показало статистически значимо более высокую частоту инфицирования H pylori среди пациентов с MALT-лимфомой задолго до развития лимфомы.Это доказательство того факта, что гастрит H pylori является заболеванием, предшествующим лимфоме MALT. Наконец, эксперименты на животных показали, что пожизненное инфицирование мышей H felis приводило к развитию лимфомы желудочного MALT в 26% случаев. ^{24, 25} В другом исследовании группа Адриана Ли трансплантировала клетки лимфомы желудка подкожно или внутрибрюшинно молодым мышам. Только у животных, инфицированных H. pylori , развились лимфомы; контрольные животные, не инфицированные H pylori , не инфицировались.Однако лимфомы располагались не в местах подкожной или внутрибрюшинной трансплантации, а в желудке животных. ²⁶ В течение длительного периода наблюдения некоторые из этих лимфом претерпели трансформацию из лимфом низкой степени злокачественности в лимфомы высокой степени. ²⁷

Напротив, у другой линии мышей пожизненное инфицирование H felis привело к тяжелой форме гастрита с атрофией, но без лимфом. Экспериментальная индукция лимфомы желудка у мышей BALB / C также возможна с использованием H heilmannii , но показатели различаются – от 14% до 89%, в зависимости от хозяина инфекции. ²⁸

Эти эксперименты на животных показывают, что факторы, необходимые для индукции развития лимфомы желудка при приобретенном MALT, вероятно, следует искать среди различных бактериальных факторов и факторов хозяина.

В этом контексте интересно отметить, что у пациентов с гастритом H heilmannii , по-видимому, лимфома MALT развивается чаще, чем у пациентов с гастритом H. pylori : в нашем материале с 1988 по 1998 год восемь лимфом MALT среди 543 пациентов с H heilmannii гастрит (1.47%) по сравнению с 1745 лимфомами MALT среди 263 680 пациентов с гастритом H. pylori (0,66%). Как и в случае с мышами BALB / C в экспериментах на животных, проведенных группой, возглавляемой Адрианом Ли, гастрит H heilmannii был более низкой степени тяжести и менее активен, чем гастрит H. pylori . ²⁹ В пользу этой связи с более легкой формой гастрита говорит тот факт, что согласованное контрольное исследование всех материалов показало, что у пациентов с MALT-лимфомой желудка гастрит имеет более низкую степень по сравнению с другими заболеваниями, вызванными H pylori . , и нет никакой разницы между оценкой желудка в антральном отделе и теле. ³⁰

Что касается инфекции слизистой оболочки желудка H heilmannii , дальнейшие исследования с тех пор показали, что существует несколько типов H heilmannii , которые могут передаваться различными домашними животными (собаками, кошками, свиньями) и могут также проявляться в виде инфекции. смешанная инфекция слизистой оболочки желудка. ³¹

Таким образом, возможно, что специальные антигены, происходящие непосредственно от тех штаммов Helicobacter , которые являются слабопатогенными, или косвенно через Т-лимфоциты, приводят к положительному отбору опухолевых клеток через рецептор антигена.Это подтверждается исследованием, показывающим, что В-клетки лимфомы MALT-типа представляют собой гипермутированные лимфоциты постгерминального центра, прошедшие отбор на антиген. ³² Кроме того, сообщалось, что изменения гена супрессора р53 участвуют в развитии и трансформации лимфом MALT; частичная инактивация приводит к развитию лимфом MALT низкой степени, а полная инактивация – к лимфомам MALT высокой степени. ³³

Молекулярно-генетические исследования MALT-лимфомы желудка, доступные в настоящее время, еще не раскрывают всей картины, и необходимы дальнейшие исследования.Поэтапное приобретение генетических аномалий можно разделить на ранние и более поздние молекулярные события. Ранние молекулярные события в эволюции MALT-лимфомы желудка включают трисомию 3 (33% желудочных MALT-лимфом), но это событие, по-видимому, не играет важной роли в прогрессировании. ³⁴ Транслокация хромосомы t (11; 18) (q21; q21) также является ранней, частой и специфической аберрацией при лимфомах MALT низкой степени злокачественности. ^{35– 37} Эта транслокация, по-видимому, отсутствует при лимфомах желудка высокой степени злокачественности, что позволяет предположить, что лимфомы MALT низкой степени злокачественности, положительные по транслокации t (11; 18) (q21; 21), могут представлять подгруппу прогрессирования в запущенная лимфома.Другим молекулярным событием на ранней стадии лимфомагенеза является сверхэкспрессия белка Bcl-2. Следовательно, ингибирование апоптоза, по-видимому, участвует в лимфомагенезе. ³⁸ Экспрессия белка p53 обратно коррелирует с экспрессией Bcl-2 и чаще встречается при лимфомах желудка высокой степени злокачественности. Следовательно, мутации гена p 53 могут быть связаны с гистологической трансформацией лимфомы низкой или высокой степени злокачественности. ^{38– 40}

Открытие полной ремиссии MALT-лимфомы низкой степени злокачественности было инициировано попытками улучшить эндоскопически-биоптический дифференциальный диагноз между реактивными лимфатическими инфильтратами и инфильтратами MALT-лимфомы низкой степени злокачественности.Мы выдвинули гипотезу, что реактивные лимфатические инфильтраты должны исчезнуть, но инфильтраты лимфомы сохранятся в ответ на эрадикацию H. pylori . ⁴¹

К нашему большому удивлению, наш первый анализ 32 пациентов, изученных в 1992 г., показал, что лимфомы MALT также могут исчезнуть: у шести из 10 пациентов с лимфомами MALT низкой степени злокачественности последующее наблюдение выявило регресс лимфомы. Двое из этих шести пациентов были подвергнуты резекции желудка; в обоих случаях мы обнаружили пустую собственную пластинку с небольшими остатками агрегатов Т-лимфоцитов, что указывает на регресс опухоли – картина, однажды наблюдаемая только после успешной химиотерапии или лучевой терапии лимфомы желудка MALT (см. рис. 3).

Полная ремиссия лимфомы MALT низкой степени после эрадикации H. pylori с типичной картиной пустой собственной пластинки.

В 1993 г. Уотерспун и его коллеги ⁴² сообщили о регрессе низкосортных лимфом MALT желудка у пяти из шести пациентов. Та же группа исследовала поведение пролиферации опухолевых клеток из лимфом MALT низкой и высокой степени злокачественности в культурах клеток с H pylori и без них, а также с Т-лимфоцитами и без них.Было обнаружено, что клетки лимфомы MALT низкой степени злокачественности пролиферируют только тогда, когда культуральная среда содержит как H pylori , так и Т-лимфоциты, но не при отсутствии H pylori или Т-лимфоцитов. Напротив, на пролиферацию клеток лимфомы высокой степени злокачественности не влияло отсутствие H. pylori или Т-лимфоцитов. ⁴³

Немецкое исследование MALT-лимфомы

Ободренные этими первоначальными результатами, мы начали изучать лечение низкосортных лимфом желудка MALT, состоящее исключительно из эрадикации H pylori .Мы уже опубликовали ряд отчетов о первоначальных результатах, а также результатах последующих обследований. ^{44– 46} Мы завершили это исследование после того, как мы включили 120 пациентов, которые все еще остаются под наблюдением.

Мы принимали только пациентов с гистологически однозначным диагнозом лимфомы MALT. Мы также выполнили рекомендацию Isaacson и Norton о том, что лимфому MALT следует диагностировать только тогда, когда результаты эндоскопии совместимы с лимфомой MALT. ⁴⁷ Контрольные эндоскопические и биопсийные исследования были выполнены после эрадикации H. pylori , сначала с интервалом в два месяца, а затем, после достижения полной ремиссии, с интервалом в шесть месяцев. Пациентам с частичной ремиссией и без изменений в опухолях рекомендовалось хирургическое лечение, лучевая терапия или химиотерапия.

Результаты, полученные после среднего периода наблюдения в 48 месяцев, были следующими: полная ремиссия 81%, частичная ремиссия 9% и отсутствие ответа на лечение 10%.

Из 12 пациентов, не ответивших на лечение, двое умерли от лимфомы, а девять были прооперированы. Обработка хирургических образцов выявила одну Т-клеточную лимфому, пять вторичных лимфом высокой степени злокачественности и три лимфомы низкой степени злокачественности. Двое пациентов прошли химиотерапию.

Из 11 пациентов с частичной ремиссией после эрадикации H. pylori , один с тех пор умер от инсульта, шесть были прооперированы, двое получили химиотерапию, а у остальных двоих заболевание стабильно без прогрессирования, и они все еще находятся под наблюдением. .

На основании эндоскопического внешнего вида невозможно предсказать, приведет ли эрадикация H pylori к ремиссии лимфомы. Диаметр опухоли не дает никаких указаний на ее ремиссию. Пациент с самой большой лимфомой MALT, имеющей диаметр 10 см, в настоящее время находится в полной ремиссии в течение семи лет после ликвидации H pylori .

Это контрастирует с глубиной инфильтрации: только в случае ранних лимфом с инфильтрацией слизистой и подслизистой оболочки можно ожидать полной ремиссии у большого процента пациентов.Вот почему эндоскопическое ультразвуковое исследование имеет большое значение для определения стадии перед лечением. Мы никогда не наблюдали полной ремиссии лимфом, инфильтрирующих собственную мышечную и серозную оболочки. ⁴⁸ Однако в одном исследовании также сообщается о полной ремиссии глубоко инфильтрирующих лимфом. ⁴⁹

Хорошим маркером для прогноза ремиссии лимфомы после эрадикации H. pylori , по-видимому, является определение t (11; 18). В то время как все пациенты, у которых не было никаких доказательств этой транслокации после эрадикации H. pylori , показали полную ремиссию, 75% из тех, у которых был обнаружен t (11; 18), не имели ремиссии. ^{50, 51}

Гистологическая диагностика полной ремиссии по биопсийному материалу остается большой проблемой. Гистологическое исследование 15 хирургических образцов не отвечающих на лечение пациентов и пациентов с частичной ремиссией показало неопределенность диагноза регресса на основе биопсии: в случаях регресса лимфомы в плоскости слизистой оболочки мы обнаружили остаточную лимфому в более глубоких слоях. стенки желудка. Даже если участки лимфомы обнаруживаются на слизистой оболочке хирургического образца, гистологический диагноз лимфомы, тем не менее, может оставаться неопределенным; во всех 15 хирургических образцах после эрадикации H pylori мы не смогли обнаружить наиболее важный критерий диагностики лимфомы MALT – лимфоэпителиальные поражения.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), проведенная на перегруппировке VDJ тяжелой цепи иммуноглобулина, не может помочь нам решить эту дилемму. При первичном диагнозе лимфомы до лечения ПЦР была положительной только в 71% случаев. С другой стороны, ПЦР оставалась положительной у 45% пациентов с полной эндоскопической, эндосонографической и гистологической ремиссией. ⁵²

Подобные результаты были получены другими авторами. ^{53, 54} Чтобы найти источник моноклональных В-клеток, мы провели исследования ПЦР после микродиссекции поверхностных участков и базальных лимфатических агрегатов в слизистой оболочке.Было обнаружено, что источник моноклональных В-клеток находится в основном в базальных лимфатических агрегатах. ⁵² Дальнейшее обследование этих пациентов должно будет показать, могут ли эти моноклональные клетки привести к рецидиву, и может ли это произойти только после повторного инфицирования H. pylori или также у H pylori отрицательных пациентов.

Из 97 наших пациентов с полной ремиссией лимфомы четверо с тех пор умерли. Причины смерти – инфаркт миокарда, инсульт и артериальная эмболия.На данный момент мы диагностировали девять рецидивов, в том числе одну лимфому высокой степени в носу и восемь рецидивирующих поражений низкой степени, одно после повторного инфицирования H pylori , при котором эрадикационная терапия H pylori снова привела к полной ремиссии лимфомы. Один пациент перенес операцию, а один получил лучевую терапию. У остальных пяти пациентов эндоскопический вид оставался нормальным; последующие гистологические исследования лимфомы не выявили.

Результаты дальнейших контрольных обследований должны будут определить, имеет ли какое-либо значение гистологический результат в очаге крошечной лимфомы и / или положительный результат ПЦР после полной ремиссии лимфомы, можно ли классифицировать любой из этих случаев как «стабильное заболевание» в «фаза покоя» ⁵⁵ или могут ли эти клетки вызывать рецидив.

У трех пациентов с полной ремиссией лимфомы мы диагностировали рак желудка на ранней стадии через 4–6 лет после эрадикации H. pylori . Все три вида рака ограничивались слизистой оболочкой, имели диаметр 4–5 мм и успешно лечились с помощью эндоскопической резекции слизистой оболочки.

Результаты других исследований

При обзоре литературы и обобщении результатов лечения MALT лимфомы желудка на разных стадиях с эрадикацией H. pylori ^{42, 44, 45, 49, 56– 70} мы обнаружили полное частота ремиссии составляет от 35% до 100% (см. таблицу 1).

Результаты лечения MALT лимфомы желудка эрадикацией H pylori

Лимфомы, возникающие при гастрите H heilmannii , также можно вылечить с помощью эрадикационной терапии. ⁷¹ Даже в отдельных случаях лимфомы MALT высокой степени эрадикация H. pylori может привести к полной ремиссии опухоли. ^{72– 77} Эрадикация H. pylori даже привела к регрессу лимфомы, локализованной не в желудке.Об этом сообщалось для случаев регресса лимфомы слюнной железы, ⁷⁸ лимфомы двенадцатиперстной кишки, ⁷⁹ лимфомы IPSID, ⁸⁰ и лимфомы прямой кишки. ⁸¹

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наше исследование и результаты, представленные в литературе, подтверждают, что гастрит H pylori и H heilmannii является заболеванием, предшествующим лимфоме MALT, и что эрадикационная терапия Helicobacter может привести к полной ремиссии примерно в 80% случаев низкой степени злокачественности. лимфома, но может произойти около 5% рецидивов в год.Даже в отдельных случаях MALT-лимфомы высокой степени и лимфом двенадцатиперстной кишки, тонкой кишки, прямой кишки и слюнных желез эрадикация Helicobacter может привести к полной ремиссии опухоли.

Следует, однако, отметить, что диагноз полной ремиссии является неопределенным, и что, несмотря на эндоскопически, эндосонографически и гистологически диагностированную полную ремиссию, моноклональные В-клетки все еще обнаруживаются в слизистой оболочке желудка у 45% этих пациентов.Необходимы дальнейшие исследования, чтобы показать важность этой моноклональности В-клеток. Также требует прояснения вопрос, следует ли ожидать дальнейшей регрессии этих моноклональных клеток с течением времени, имеем ли мы дело с непролиферативным, стабильным заболеванием в дремлющей фазе или существует опасность рецидива.

До тех пор, пока не будут даны ответы на эти вопросы и пока недоступны долгосрочные результаты, охватывающие период наблюдения более пяти лет, эрадикация Helicobacter в качестве единственного лечения лимфомы MALT остается экспериментальной и должна ограничиваться исследованиями, в которых регулярно проводятся Могут быть выполнены эндоскопические и биоптические контрольные обследования.

Тем не менее, настоящие результаты уже подтверждают название обзора Питера Исааксона: «Желудочная лимфома MALT: от концепции до лечения». ⁸²

РЕЗЮМЕ

За последние 20 лет огромные успехи были достигнуты в области MALT-лимфом желудка. До начала 1980-х годов эта лимфома диагностировалась почти только на поздней стадии и по большей части как очень злокачественное поражение. Только после публикации Исааксоном концепции MALT-лимфомы в 1983 году стало возможным диагностировать ранние стадии этой лимфомы.

Наши текущие знания о связи между инфекцией H pylori и лимфомами MALT были начаты с открытия, что лимфатическая ткань, связанная со слизистой оболочкой (MALT) желудка, всегда является следствием инфекции H. pylori .

На основе этих открытий была разработана гипотеза о том, что дифференциальный диагноз MALT-лимфомы и реактивных лимфатических инфильтратов в биопсийном материале можно улучшить, удалив H. pylori .Эта гипотеза утверждала, что реактивный инфильтрат должен исчезнуть после эрадикации H pylori , но инфильтраты лимфомы должны сохраниться. Однако исследования, основанные на этих соображениях, показали, что MALT-лимфома низкой степени злокачественности на ранней стадии с инфильтрацией слизистой и подслизистой оболочки также зажила после эрадикационной терапии H. pylori .

Это побудило нас в 1994 году начать исследование по лечению лимфомы низкой степени злокачественности с помощью только эрадикации H. pylori .После обследования 120 пациентов мы прекратили это исследование. Результатом была полная ремиссия 81%, частичная ремиссия 9% и отсутствие ответа на лечение 10%. Сопоставимые исследования, проведенные в Европе и Японии, дали аналогичные результаты (частота полной ремиссии от 35% до 93%).

Анализ наших собственных случаев показал, что результаты эндоскопии не могут быть использованы для получения прогноза ремиссии после эрадикации H. pylori . Большее значение имеет глубина проникновения лимфомы.Только для лимфом, инфильтрирующих слизистую и подслизистую, но не инфильтрирующих более глубокие слои стенки, мы смогли достичь полной ремиссии.

ПЦР для диагностики и последующего наблюдения за ремиссией не является надежным: при первичном диагнозе она показывает моноклональность в 71% лимфом, но также в 45% случаев с полной ремиссией. Источником этой моноклональности являются стойкие базальные агрегаты лимфоцитов. У девяти наших пациентов с полной ремиссией был обнаружен рецидив лимфомы: лимфома слизистой носа высокой степени злокачественности у одного и местный рецидив у восьми.Эти последние, однако, были диагностированы только на основании гистологического исследования, при этом эндоскопический вид был нормальным. Остается ответить на вопрос, были ли эти рецидивы просто непролиферативной «фазой покоя» моноклональных В-клеток. Отчеты о клинических случаях, опубликованные в последние годы, показали, что лимфомы высокой степени злокачественности также могут пройти полную ремиссию после лечения H. pylori .

ССЫЛКИ

1. ↵

   Палмер Е .Саркома желудка. Am J Dig Dis 1950; 17: 186–95.

2. ↵

   Исааксон PG , Райт DH. Злокачественная лимфома из лимфоидной ткани, связанной со слизистой оболочкой: отличительный тип В-клеточной лимфомы. Рак 1983; 52: 1410–16.

3. ↵

   Уоррен Дж. Р. , Маршалл Б.Дж. Неопознанные изогнутые бациллы на эпителии желудка при активном хроническом гастрите. Lancet1983; 330: 1273–5.

4. ↵

   Мураяма Х , Кикучи М., Эймото Т., и др. .Ранняя лимфома сосуществует с реактивной лимфоидной гиперплазией желудка. Acta Pathol Jpn 1984; 34: 679–86.

5. ↵

   Радашкевич Т. , Драгошич Б., Бауэр П. Злокачественные лимфомы желудочно-кишечного тракта лимфоидной ткани, связанной со слизистой оболочкой: факторы, влияющие на прогноз. Гастроэнтерология 1992; 102: 1628–38.

6. ↵

   Mohri N . Первичные неходжкинские лимфомы желудка в Японии.Арка Вирха A1987; 411: 295–8.

7. ↵

   Stolte M , Eidt S. Диагностика ранней лимфомы желудка. Z Gastroenterol1991; 29: 6–10.

8. ↵

   Weismüller J , Seifert E, Goronzy R, Stolte M. Das maligne Lymphom des Magens — Fortschritte in der Frühdiagnostik. Schweiz Rundschau Med (Praxis) 1986; 75: 1531–2.

9. ↵

   Eidt S , Stolte M.Доказательства злокачественного цикла при ранней лимфоме желудка. Эндоскопия, 1994; 26: 295–8.

10. ↵

    Eidt S , Stolte M, Fischer R. Гастрит Helicobacter pylori и неходжкинская лимфома желудка. Дж. Клин Патол, 1994; 47: 436–9.

11. ↵

    Dragosics B , Bauer P, Radaszkiewicz T. Первичные неходжкинские лимфомы желудочно-кишечного тракта. Ретроспективное клинико-патологическое исследование 150 случаев.Cancer 1985; 55: 1060–73.

12. ↵

    Cogliatti SB , Schmid U, Schumacher U, и др. . Первичная B-клеточная лимфома желудка: клинико-патологическое исследование 145 пациентов. Гастроэнтерология, 1991; 101: 1159–70.

13. ↵

    Исааксон PG , Спенсер Дж. Райт DH. Классификация первичных лимфом кишечника. Lancet 1988; 2: 1148–9.

14. ↵

    Harris NL , Jaffe ES, Stein H, и др. .Пересмотренная европейско-американская классификация лимфоидных новообразований. Предложение международной группы по изучению лимфомы. Blood1994; 84: 1361–92.

15. ↵

    Hamilton SR , Aaltonen LA, ред. Опухоли пищеварительной системы. Классификация опухолей Всемирной организации здравоохранения . Лион: ARCPress, 2000.

    .
16. ↵

    Isaacson PG , Spencer J. Злокачественная лимфома слизистой лимфоидной ткани.Гистопатология 1987; 11: 445–62

17. ↵

    Исааксон PG , Нортон AJ. Экстранодальные лимфомы . Эдингбург: Черчилль Ливингстон, 1994.

18. ↵

    De Jong D , Boot J, van Heerde P, et al . Гистологическая оценка лимфомы желудка: критерии до лечения и клиническая значимость. Гастроэнтерология 1997; 112: 1466–74.

19. ↵

    Wyatt JI , Rathbone BJ.Иммунный ответ слизистой оболочки желудка на Campylobacter pylori. Scand J Gastroenterol 1988; 23 (прил. 142): 44–9.

20. ↵

    Stolte M , Eidt S. Лимфоидные фолликулы в слизистой оболочке антрального отдела: иммунный ответ на Campylobacter pylori. Дж. Клин Патол, 1989; 42: 1269–71.

21. ↵

    Doglioni C , Wotherspoon AC, Moschinie A, и др. . Высокая частота первичной лимфомы желудка на северо-востоке Италии.Lancet1992; 339: 1175–6.

22. ↵

    Wotherspoon AC , Ortiz-Hidalgo C, Falzon MR, и др. . Helicobacter pylori-ассоциированный гастрит и первичная B-клеточная лимфома желудка. Lancet1991; 338: 1175–6.

23. ↵

    Парсонне Дж. , Хансен С., Родригес Л., и др. . Инфекция Helicobacter pylori и лимфома желудка. N Engl J Med1994; 330: 1267–71.

24. ↵

    Энно А. , О’Рурк Дж., Ли А., и др. .MALToma-подобные поражения желудка, возникшие в результате длительной инфекции Helicobacter у мышей. Ам Дж. Гастроэнтерол, 1994; 89: 1357.

25. ↵

    Энно А , О’Рурк Дж., Хоулетт CR, и др. . MALToma-подобные поражения слизистой оболочки желудка мышей после длительного инфицирования Helicobacter felis: модель лимфомы желудка Helicobacter pylori на мышах. Am J Pathol, 1995; 147: 217–22.

26. ↵

    Энно А , О’Рурк Дж., Хоулетт CR, и др. .Реанимация от мыши к мыши низкосортной лимфомы MALT, вызванной длительной инфекцией Helicobacter. Предварительное исследование пересаженных опухолей. Гастроэнтерология 1996; 110: A536.

27. ↵

    Энно А , О’Рурк Дж., Брей С., и др. . Антиген-зависимое прогрессирование лимфомы, ассоциированной со слизистой оболочкой лимфоидной ткани (MALT), в желудке. Влияние антимикробной терапии на лимфому желудка MALT у мышей. Am J Pathol 1998; 152: 1625–32.

28. ↵

    О’Рурк Дж. Л. , Энно А., Диксон М. Ф., и др. . В-клеточные лимфомы желудка, индуцированные у одной линии мышей различными изолятами Helicobacter heilmannii. Сходства и различия. Gut1995; 37 (приложение 1): A7.

29. ↵

    Stolte M , Wellens E, Bethke B, и др. . Helicobacter heilmannii (ранее Gastrospirillum hominis) гастрит: инфекция, передающаяся от животных? Scand J Gastroenterol1994; 29: 1061–4.

30. ↵

    Meining A , Stolte M, Hatz R, и др. . Различная степень и распространение гастрита при заболеваниях, ассоциированных с Helicobacter pylori. Вирхов Arch2997; 431: 11–15.

31. ↵

    Trebesius K , Adler K, Vieth M, et al . Специфическое обнаружение и распространенность Helicobacter heilmannii-подобных организмов в слизистой оболочке желудка человека с помощью флуоресцентной гибридизации in situ и частичного секвенирования 16S рибосомной ДНК.J Clin Microbiol2001; 39: 1510–16.

32. ↵

    Qin Y , Greiner A, Trunk MJF, и др. . Соматическая гипермутация при B-клеточной лимфоме, ассоциированной со слизистой оболочкой, низкой степени злокачественности. Blood1995; 86: 3528–34.

33. ↵

    Du M , Peng H, Singh N, и др. . Накопление аномалий р53 связано с прогрессированием лимфомы лимфоидной ткани, связанной со слизистой оболочкой.Blood1992; 339: 745–7.

34. ↵

    Hoeve MA , Gisbertz IAM, Schoutten HC, и др. . MALT-лимфома низкой степени злокачественности, MALT-лимфома высокой степени и диффузная большая B-клеточная лимфома имеют разную частоту трисомии. Leukemia 1999; 13: 799–807.

35. ↵

    Ott G , Katzenberger T, Greiner A, et al . Транслокация хромосомы t (11; 18) (q21; q21) является частой и специфической аберрацией при низкоуровневой, но не высокой злокачественной неходжкинской лимфоме типа лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой (MALT).Cancer Res1997; 57: 3944–8.

36. Агаки Т. , Мотеги М., Тамура А, и др. . Новый ген, MALT1 в 18q21, участвует в t (11,18) (q21; q21), обнаруживаемом в B-клеточной лимфоме низкой степени злокачественности лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой. Онкоген1999; 18: 5785–94.

37. ↵

    Dierlamm J , Baens M, Wlodarska I, et al . Ген ингибитора апоптоза AP12 и новый ген 18q, MLT, рекуррентно реаранжируются в t (11; 18) (q21; q21), ассоциированном с лимфомой лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой.Blood1999; 93: 3601–9.

38. ↵

    Охаши С. , Сгава К., Окамура С., и др. . Клинико-патологическое исследование лимфомы лимфоидной ткани, связанной со слизистой оболочкой желудка. Cancer2000; 88: 2210–19.

39. Fa YS , Ризкалла К., Энгель Дж. Интерстициальная делеция 8 (q23; q21) при диффузной большой B-клеточной лимфоме желудка. Cancer Genet Cytogenet1999; 115: 28–31.

40. ↵

    Ferreri AJ , Cordio S, Paro S, и др. .Терапевтическое лечение первичных лимфом желудка высокой степени злокачественности I-II стадии. Онкология, 1999; 56: 274–82.

41. ↵

    Столте М . Helicobacter pylori и MALT-лимфома. Lancet1992; 339: 745–7.

42. ↵

    Wotherspoon AC , Doglioni C, Diss TC, и др. . Регресс первичной низкосортной B-клеточной лимфомы желудка слизисто-ассоциированного лимфоидного типа после эрадикации Helicobacter pylori.Lancet1993; 342: 575–7.

43. ↵

    Hussell T , Isaacson PG, Crabtree JE, Spencer J. Ответ клеток низкосортной B-клеточной лимфомы желудка ассоциированной со слизистой оболочкой лимфоидной ткани на Helicobacter pylori. Lancet1993; 342: 571–4.

44. ↵

    Bayerdörffer E , Neubauer A, Rudolph B, et al . Группа исследования лимфомы MALT. Регресс первичной лимфомы желудка слизисто-ассоциированного тканевого типа после лечения инфекции Helicobacter pylori.Lancet1995; 345: 1591–4.

45. ↵

    Neubauer A , Thiede C, Morgner A, и др. . Лечение инфекции Helicobacter pylori и продолжительность ремиссии лимфомы лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой желудка низкой степени. J Natl Cancer Inst 1997; 89: 1350–5.

46. ↵

    Morgner A , Bayerdörffer E, Neubauer A, и др. . MALT-лимфома желудка и ее связь с инфекцией Helicobacter pylori: лечение и патогенез заболевания.Micros Res Tech3000; 48: 349–56.

47. ↵

    Исааксон PG , Нортон AJ. Экстранодальные лимфомы . Эдинбург: Черчилль Ливингстон, 1994.

48. ↵

    Sackmann M , Morgner A, Rudolph B, et al . Регресс лимфомы желудка MALT после эрадикации Helicobacter pylori прогнозируется с помощью эндосонографического определения стадии. Группа изучения лимфомы MALT. Гастроэнтерология 1997; 113: 1087–90.

49. ↵

    Steinbach G , Ford R, Glober G, и др. . Лечение антибиотиками лимфомы желудка из лимфоидной ткани, связанной со слизистой оболочкой. Ann Intern Med, 1999; 131: 88–95.

50. ↵

    Alpen B , Neubauer A, Dirlamm J, et al . Транслокация t (11; 18) отсутствует в ранней В-клеточной лимфоме маргинальной зоны желудка MALT-типа, отвечающей на эрадикацию инфекции Helicobacter pylori.Blood2000; 95: 4012–15.

51. ↵

    Liu H , Ruskone-Formeshaux A, Lavergue-Slove A, и др. . Устойчивость t (11; 18) лимфомы лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой желудка, к эрадикационной терапии Helicobacter pylori. Lancet2001; 357: 39–40.

52. ↵

    Thiede C , Wündisch T, Alpen B, и др. . Длительное сохранение моноклональных В-клеток после излечения от инфекции Helicobacter pylori и полная гистологическая ремиссия в B-клеточной лимфоме, ассоциированной со слизистой оболочкой желудка.Дж. Клин Онкол, 2001; 19: 1600–9.

53. ↵

    Savio A , Franzin G, Wotherspoon AC, и др. . Диагностика и последующее наблюдение после лечения Helicobacter pylori-положительной лимфомы желудка из слизистой лимфоидной ткани: гистология, полимеразная цепная реакция или и то, и другое? Blood1996; 87: 1255–60.

54. ↵

    Aiello A , Giardini R, Tondini C, и др. . Анализ клональности на основе ПЦР: надежный метод диагностики и последующего наблюдения за консервативно леченными B-клеточными MALT-лимфомами желудка? Гистопатология 1999; 34: 326–30.

55. ↵

    Isaacson PG , Diss TC, Wotherspoon AC, и др. . Долгосрочное наблюдение за MALT-лимфомой желудка, леченной эрадикацией H. pylori с помощью антибиотиков. Гастроэнтерология, 1999; 117: 750–1.

56. ↵

    Savio A , Franzin G, Wotherspoon AC, и др. . Диагностика и последующее наблюдение после лечения Helicobacter pylori-положительной лимфомы желудка из лимфоидной ткани, связанной со слизистой оболочкой; гистология, полимеразная цепная реакция или и то, и другое? Blood1996; 87: 1255–60.

57. ↵

    Roggero E , Zucca E, Pinotti G, и др. . Ликвидация инфекции Helicobacter pylori при первичной лимфоме желудка низкой степени злокачественности из лимфоидной ткани слизистой оболочки. Ann Intern Med, 1995; 122: 767–79.

58. Fischbach W , Kolve ME, Engemann R, et al . Неожиданный успех эрадикации Helicobacter pylori при лимфоме низкой степени злокачественности. Гастроэнтерология 1996; 110: A512.

59. Montalban C , Manzanal A, Boixeda D, et al . Эрадикация Helicobacter pylori для лечения MALT-лимфомы низкой степени злокачественности: последующее наблюдение вместе с последовательными молекулярными исследованиями. Энн Онкол 1997; 8 (приложение 2).

60. Pinotti G , Zucca E, Roggero E, и др. . Клинические особенности, лечение и исходы у 93 пациентов с MALT-лимфомой низкой степени злокачественности.Лимфома Лейка 1997; 26: 527–37.

61. Nobre-Leitao C , Lage P, Cravo M, и др. . Лечение MALT-лимфомы желудка с помощью эрадикации Helicobacter pylori: исследование, контролируемое эндоскопической ультрасонографией: Am J Gastroenterol1998; 93: 732–6.

62. Като Т. , и др. . Регресс желудочной лимфомы MALT низкой степени злокачественности после эрадикации Helicobacter pylori.Кишечник желудка 1999; 34: 1345–52.

63. Накамура Т. , и др. . Изменения эндоскопических, рентгенографических и патологических данных MALT-лимфомы желудка после лечения инфекции H. pylori. Кишечник желудка 1999; 34: 1353–66.

64. Suzuki T , и др. . Клинико-патологические особенности лимфомы MALT. Желудок и кишечник 1999; 34: 1367–79.

65. Oda I , и др. .Эндоскопическая оценка эрадикации Helicobacter pylori. Кишечник желудка 1999; 34: 1381–8.

66. Yamashita H , и др. . Гистологические особенности низкосортной лимфомы MALT, демонстрирующие полную регрессию после эрадикации Helicobacter pylori, и время прогнозирования ее эффективности – ценность клинического типирования, основанного на результатах эндосонографии. Желудок и кишечник 1999; 34: 1389–96.

67. Suekane H , и др. .Клинический курс и практические рекомендации после искоренения Helicobacter pylori – ценность клинического типирования, основанного на результатах эндосонографии. Кишечник желудка 1999; 34: 1397–409.

68. Thiede C , Wündisch T, Neubauer B, et al . Ликвидация Helicobacter pylori и стабильность выбросов в B-клеточных лимфомах желудка низкой степени злокачественности из лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой: результаты продолжающегося многоцентрового исследования. Cancer Res2000; 156: 125–33.

69. Fischbach W , Dragosics B, Kolve-Goebeler ME, и др. . Первичная В-клеточная лимфома желудка: результаты проспективного многоцентрового исследования. Гастроэнтерология 2000; 119: 1191–202.

70. ↵

    Ruskoné-Fourmestaux A , Lavergne A, Aegerter PH, и др. . Факторы прогнозирования регресса MALT-лимфомы желудка после лечения анти-Helicobacter pylori.Gut2001; 48: 297–303.

71. ↵

    Morgner A , Lehn N, Andersen LP, и др. . Связанная с Helicobacter heilmannii первичная желудочная лимфома MALT низкой степени злокачественности: полная ремиссия после излечения инфекции. Гастроэнтерология 2000; 118: 821–8.

72. ↵

    Ng WW , Lam CP, Chau WK, и др. . Регресс лимфомы лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой желудка высокой степени злокачественности, вызванной Helicobacter pylori, после трехкратной антибактериальной терапии.Гастроинтест Endosc2000; 51: 93–6.

73. Morgner A , Miehlke S, Fischbach W, и др. . Полная ремиссия первичной B-клеточной лимфомы желудка высокой степени злокачественности после излечения от инфекции Helicobacter pylori. Дж. Клин Онкол, 2001; 19: 2041–8.

74. Falco-Jover G , Martinez-Egea A, Sanchez CJ, и др. . Регресс первичной B-клеточной лимфоидной ткани слизистой оболочки желудка (MALT) после эрадикации Helicobacter pylori.Ред. Эсп Энферм Dig1999; 91: 541–8.

75. Сеймур JF , Андерсон Р.П., Татхал П.С. Регресс лимфомы желудка на фоне терапии инфекции Helicobacter pylori. Энн Интерн Мед 1997; 127: 247.

76. Chen LT , Cheng AL, Shyu Ly, et al . Антихеликобактерная терапия при лимфоидной лимфоме желудка, ассоциированной со слизистой оболочкой, высокой степени злокачественности. Proc Am Soc Clin Oncol 1998; 17: 289A.

77. ↵

    Roggero E , Copie-Bergman C, Traulle C, и др. . Регресс В-клеточной лимфомы желудка высокой степени злокачественности после ликвидации инфекции Helicobacter pylori. Энн Онкол, 1999; 10: 67.

78. ↵

    Alkan S , Karcher DS, Newman MA, Cohen P. Регрессия MALT лимфомы слюнной железы после лечения Helicobacter pylori. Lancet1996; 348: 269.

79. ↵

    Nagashima R , Takeda H, Maeda K, et al .Регресс лимфомы лимфоидной ткани, связанной со слизистой двенадцатиперстной кишки, после эрадикации Helicobacter pylori. Гастроэнтерология 1996; 111: 1674–8.

80. ↵

    Fischbach W , Tacke W, Greiner A, и др. . Регресс иммунопролиферативного заболевания тонкого кишечника после эрадикации Helicobacter pylori. Lancet1997; 349: 31–2.

81. ↵

    Мацумото Т , Лида М., Симидзу М.Регресс лимфомы прямой кишки, связанной со слизистой оболочкой, после эрадикации Helicobacter pylori. Lancet1997; 350: 115–16.

82. ↵

    Исааксон PG . Желудочная лимфома MALT: от концепции до лечения. Энн Онкол, 1999; 10: 637–45.

Регулярно ешьте грецкие орехи, чтобы уменьшить негативные последствия инфекции H. pylori: Исследование | Здоровье

Новое исследование с использованием моделей мышей, распространенное в Журнале клинической биохимии и питания, рекомендует, чтобы регулярное потребление грецких орехов могло быть многообещающим средством для уменьшения негативных результатов, связанных с Helicobacter pylori (H.pylori), широко распространенной бактериальной инфекции, поражающей большую часть населения мира.

Используя модели мышей, исследователи из Исследовательского центра профилактики рака CHA в Корее обнаружили предварительные доказательства того, что диета, богатая грецкими орехами, может помочь защитить от негативных последствий, связанных с инфекцией H. pylori. В частности, исследование показало, что экстракты грецкого ореха, полученные из цельных грецких орехов, могут помочь создать защитные белки и противовоспалительные действия в кишечнике, которые могут защитить от H.pylori и приводит к раку у мышей. Исследование было поддержано Комиссией по орехам Калифорнии.

Распространенность H. pylori наиболее распространена в развивающихся странах, поскольку она, как правило, связана с социально-экономическим статусом и гигиеническими условиями и, как считается, передается от человека к человеку или даже через пищу и воду. Инфекция H. pylori является основной причиной язв желудка и тонкого кишечника, а также рака желудка и язвенной болезни. Хотя лечение в настоящее время доступно, существуют опасения по поводу растущей устойчивости бактерий к антибиотикам.

Из-за возрастающих проблем, связанных с устойчивостью к антибиотикам, исследователи изучали диетические и другие небактериальные подходы для улучшения воздействия инфекции H. pylori, как в этом новом исследовании.

Это не первый случай, когда грецкие орехи связывают со снижением риска развития рака желудочно-кишечного тракта у мышей. Два других исследования на животных, опубликованные в журнале Cancer Prevention Research and Nutrients, показали, что грецкие орехи в рационе могут подавлять развитие опухоли толстой кишки, изменяя кишечные бактерии, а также подавлять прогрессирование колоректального рака путем подавления ангиогенеза – развития новых кровеносных сосудов, которые облегчают рост кишечных бактерий. раковые клетки.

Исследования на животных важны для получения исходной информации и могут быть использованы в качестве основы для будущих исследований на людях. Основываясь на имеющихся данных, включая это исследование грецких орехов, диетические подходы к уменьшению симптомов инфекции H. pylori, таких как воспаление, представляются целесообразными для изучения в хорошо спланированном клиническом исследовании для подтверждения результатов.

Влияние инфекции Helicobacter pylori и различных компонентов H. pylori на пролиферацию и апоптоз эпителиальных клеток и фибробластов желудка

В течение H . pylori у человека, бактерии прикрепляются к эпителиальным клеткам желудка, вызывая дестабилизацию эпителиального барьера желудка, что приводит к развитию воспалительной реакции, связанной с инфильтрацией иммунокомпетентных клеток в ответ на ИЛ-6, ИЛ-8 и потенциально ИЛ-33 [50–51].Использование опытной модели H . Инфекция pylori у морских свинок позволяет нам изучить типичный результат H . pylori [52–53], главным образом потому, что морские свинки – единственные лабораторные животные, у которых структура желудка напоминает структуру человеческого органа. Более того, морские свинки склонны к развитию воспаления в ответ на секрецию IL-8, IL-6 и IL-33 эпителиальными и иммунокомпетентными клетками желудка [42, 53–54]. В нашем исследовании мы использовали модель in vivo экспериментальной морской свинки H . pylori и in vitro клеточных моделей первичных эпителиальных клеток желудка и фибробластов морских свинок, обработанных H . pylori или его растворимые компоненты для оценки эффекта H . pylori и разные H . pylori , влияющих на пролиферацию и апоптоз эпителиальных клеток и фибробластов желудка, а также на подвижность и прорегенеративный потенциал этих клеток.

Исследование на животных – реакция на экспериментальный

В нашей модели статус H . pylori Инфекция через 7 и 28 дней инокуляции была подтверждена гистологическими, молекулярными и серологическими методами, как описано ранее [33]. Для гистологического анализа мы применили несколько принципов Сиднейской системы – классификации гастрита, введенной в 1990 г. и обновленной в 1995 г. [55]. Слизистая оболочка желудка морских свинок инокулирована H . pylori был колонизирован этими бактериями, как показано окрашиванием тканей по Гимзе и Вартин-Старри, которые использовались для визуализации HLO (рис. 1A). В желудочной ткани инфицированных, но не контрольных животных, последовательности cagA и ureC были обнаружены с помощью ПЦР как продукт из 294 пар оснований (п.н.) и продукт из 298 п.о. соответственно (рис. 1B) . В предыдущем исследовании на том же виде мы показали, что заражение морских свинок H . pylori сопровождалось усилением экспрессии муцина 5 (MUC5AC) и отложением детерминант Льюиса в слизистой оболочке желудка, особенно через 7 дней после инокуляции, что коррелировало с усиленной колонизацией тканей желудка бактериями [44]. Инфицированные животные ответили на бактерии производством анти- H . pylori IgM и IgG. Уровень анти- H . pylori IgM в образцах сыворотки животных было выше через 7 дней, чем через 28 дней после инокуляции, что указывает на острую инфекцию, тогда как животные через 28 дней после инокуляции показали более высокий уровень анти- H . pylori IgG, чем через 7 дней после инокуляции (рис. 1C i, ii) . Аналогично концентрация H . pylori антигенов в образцах стула животных было выше через 28 дней, чем через 7 дней после инокуляции, что подтвердило персистентность инфекции (рис. 1C iii). Гистопатологический анализ срезов ткани желудка, окрашенных гематоксилином и эозином, показал воспаление в ткани желудка в H . pylori -инфицированных животных (рис. 2A i). Инфекция сопровождалась значительной инфильтрацией гранулоцитов (Ly-6G-положительные клетки) в течение 7–28 дней после инокуляции, которая была сильнее через 28 дней (степень 3), чем через 7 дней (степень 2). (Рис. 2B i, II). Воспалительная реакция стала хронической через 28 дней после инокуляции, о чем свидетельствует инфильтрация лимфоцитов, которые располагались в основном в подслизистой оболочке (степень 3) (рис. 2A i). Однако через 7 дней после инокуляции было обнаружено большее количество CD4 + Т-лимфоцитов, чем CD8 + Т-лимфоцитов, тогда как через 28 дней после инокуляции количество CD8 + Т-лимфоцитов было выше, чем количество CD4 + Т-клеток (Рис. 2C i, ii и Рис 2D i, ii, соответственно) .Эти результаты указывают на вовлечение различных субпопуляций Т-лимфоцитов в течение инфекции. Ранее в vitro клеточных культур проводили с лимфоцитами из мезентериальных лимфатических узлов H . pylori -инфицированные морские свинки в присутствии растворимого H . pylori , лимфоциты, особенно CD4-положительные Т-клетки, интенсивно пролиферировали, что указывает на доминирование этой популяции лимфоцитов у инфицированных морских свинок через четыре недели после заражения [42].В том же исследовании мы проанализировали уровни мРНК для цитокинов, происходящих из моноцитов, таких как интерлейкин (IL) -8, IL-1α и интерферон гамма (IFN-γ), а также для цитокинов, полученных из лимфоцитов, включая трансформирующий фактор роста бета (TGF -β), в культурах клеток лейкоцитов, полученных из контрольных лимфатических узлов брыжейки, и H . pylori -инфицированные морские свинки [42]. В моноцитах как неинфицированных, так и инфицированных животных была обнаружена мРНК IL-8, тогда как мРНК для IL-1β была обнаружена только в моноцитах неинфицированных животных.МРНК TGF-β была обнаружена в лимфоцитах контроля и H . pylori -инфицированные морские свинки. Интересно, что значительно повышенный уровень мРНК для IFN-γ был обнаружен в лимфоцитах из H . pylori инфицировали по сравнению с неинфицированными животными и размножались в культурах клеток только в ответ на H . pylori , но не только в среде для культивирования клеток [42]. Эти результаты были совместимы с исследованием Kronsteiner et al.[56], которые показали, что H . Инфекция pylori у морских свинок вызвала преобладающий системный ответ, характеризующийся повышенным количеством T CD4-положительных лимфоцитов. Наши предварительные результаты на морских свинках через 60 дней после инокуляции H . pylori подтвердил сохранение хронической воспалительной реакции (неопубликованные данные). Ткань желудка неинфицированных животных не показала признаков усиленного воспаления (фиг. 2). Наши наблюдения из настоящего исследования развития воспалительного процесса в ответ на H . pylori соответствуют результатам, полученным другими группами, которые изучали развитие воспалительной реакции в слизистой оболочке желудка H . pylori -инфицированные морские свинки [33, 57–58]. Sjoredn et al. [59] выявили массивную инфильтрацию мононуклеарных клеток и эозинофилов в слизистой оболочке желудка морских свинок через 3 недели после инокуляции H . пилори . Sun et al. [60] показали H . pylori – индуцированный гастрит у монгольских песчанок, который был связан с дефектами желудочного барьера, распространяющимися из антрального отдела в тело с течением времени.

Рис. 1. Гистологическая, серологическая и молекулярная оценка H . pylori на экспериментальной модели морской свинки.

(A) Репрезентативные изображения срезов ткани желудка, полученные от морских свинок, неинфицированных или инфицированных H . pylori через 7 и 28 дней после инокуляции, окрашивают методом Гимзы и Вартина-Старри и визуализируют в световом микроскопе (YS100, Nikon, Япония). Красные стрелки и квадраты указывают местонахождение Helicobacter -подобных организмов (HLO). (B) Электрофоретическое разделение ureC и cagA H . pylori продукты амплификации гена с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) образцов ткани желудка, выделенных из неинфицированных или H . pylori инфицированных морских свинок через 7 дней после инокуляции. Образцы обрабатывали в 1,4% агарозном геле в присутствии маркера размером (M) 100 п.н. и контролей: (C [+] – положительный контроль – H . ДНК pylori , выделенная из H . pylori суспензия при плотности 1х10 ⁸ КОЕ / мл, C [-] – отрицательный контроль, реакционная смесь без ДНК). ( i ) Отсутствие продуктов амплификации генов cagA и ureC в образцах ткани желудка, выделенных от контрольных животных. ( ii ) Наличие ДНК (продуктов амплификации) для CagA (ген cagA – 298 п.н.) и UreC (амплификация гена ureC – 294 п.н.) в образцах ткани желудка, выделенных от животных, инфицированных H . пилори . (C) Серологические методы определения сывороточного уровня анти- H . pylori IgM ( i ), анти- H . pylori IgG ( ii ) и H . pylori антигенов ( iii ) в образцах стула морских свинок, не инфицированных или инфицированных H . pylori через 7 и 28 дней после инокуляции. Были исследованы пять животных на группу для контроля и 5 животных на группу для инфицированных животных (через 7 и 28 дней после инокуляции, 5 + 5).Результаты представлены в виде средних значений четырех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах для каждого экспериментального варианта. Статистический анализ проводился с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Статистическая значимость * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 была получена для H . pylori инфицированных животных (через 7 и 28 дней после инокуляции) против контрольных животных; Н . pylori инфицированных животных через 7 дней против животных через 28 дней после последней инокуляции.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220636.g001

Рис. 2. Инфильтрация слизистой оболочки желудка морской свинки воспалительными клетками в ответ на H . pylori инфекция.

(A) Репрезентативные изображения окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) ткани желудка морских свинок, неинфицированных (n = 5) или инфицированных экспериментально H . pylori через 7 дней (n = 5) и 28 дней после инокуляции (n = 5) сфотографировали в световом микроскопе (YS100 Nikon, Япония).Желтые квадраты показывают инфильтрацию воспалительных клеток. (B) Репрезентативные изображения нейтрофилов (маркер Ly-6G, FITC – зеленый) в ткани желудка неинфицированных (n = 5) и H . pylori инфицированных животных (через 7 и 28 дней после инокуляции, n = 5 + 5). Ядра клеток контрастировали DAPI (синий). Срезы тканей фотографировали в конфокальном микроскопе (LeicaTCS SP) при длинах волн: возбуждение FITC 495 нм и испускание 519 нм; DAPI возбуждение 345 нм и излучение 455 нм. (C) Репрезентативные изображения лимфоцитов CD4 + (FITC – зеленый) в ткани желудка неинфицированных (n = 5) и H . pylori инфицированных животных (через 7 и 28 дней после инокуляции, n = 5 + 5). Ядра клеток контрастировали DAPI (синий). Срезы тканей фотографировали в конфокальном микроскопе (LeicaTCS SP) при длинах волн: возбуждение FITC 495 нм и испускание 519 нм; DAPI возбуждение 345 нм и излучение 455 нм. (D) Репрезентативные изображения лимфоцитов CD8 + (FITC – зеленый) в ткани желудка неинфицированных (n = 5) и H . pylori инфицированных животных (через 7 и 28 дней после инокуляции, n = 5 + 5). Ядра клеток контрастировали DAPI (синий). Срезы тканей фотографировали в конфокальном микроскопе (LeicaTCS SP) при длинах волн: возбуждение FITC 495 нм и испускание 519 нм; DAPI возбуждение 345 нм и излучение 455 нм. (i) Интенсивность флуоресценции Ly6G, CD4 + и CD8 + положительных клеток в ткани желудка неинфицированных (n = 5) и H . pylori инфицированных животных (7 и 28 дней после инокуляции, n = 5 + 5), измеренные в программе Image J версии 1.48v (Национальный институт здоровья, США). Результаты представлены в виде средних значений четырех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах для каждого экспериментального варианта. Статистический анализ проводился с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Статистическая значимость * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 была получена для H . pylori инфицированных животных (через 7 и 28 дней после инокуляции) против контрольных животных; Н . pylori инфицированных животных через 7 дней против животных через 28 дней после последней инокуляции.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220636.g002

Важно отметить, что окислительный стресс, вызванный H . pylori компонентов или эндогенных факторов могут вносить вклад в патофизиологические и гистопатологические изменения, включая аутофагию и апоптоз, приводящие к гастриту и даже развитию рака [61]. В нашем исследовании модель H . pylori -индуцированная воспалительная реакция в слизистой оболочке желудка инфицированных животных была связана с увеличением окислительного стресса, более значимо через 7 дней, чем через 28 дней после инокуляции, что мы оценили путем мониторинга перекисного окисления липидов в ткани желудка (обнаружение 4HNE) ( Фиг.3A) и концентрация MPO (Фиг.3B). Самый высокий уровень 4HNE наблюдался у животных, инфицированных H . pylori через 7 дней после инокуляции и оставался на повышенном уровне через 28 дней, хотя он был ниже, чем через 7 дней после инокуляции. Это может указывать на инициирование антиоксидантного ответа хозяина. Повышенная концентрация МПО была обнаружена в желудочной ткани инфицированных животных. Он был выше через 28, чем через 7 дней после инокуляции, что соответствовало увеличению количества гранулоцитов в эпителии желудка в ходе инфекции.

Рис. 3. Обнаружение 4HNE, MPO и MMP-9 в ткани желудка H . pylori инфицированных морских свинок.

(A) Оценка окислительного стресса в ткани желудка морских свинок, неинфицированных или инфицированных H . pylori через 7 и 28 дней после инокуляции в зависимости от присутствия 4-гидроксиноненала (4HNE). ( i ) Интенсивность флуоресценции 4HNE в ткани желудка, измеренная с использованием программного обеспечения Image J версии 1.48v (Национальный институт здоровья, США). (ii) Репрезентативные изображения 4HNE в ткани желудка, визуализированные в конфокальном микроскопе (LeicaTCS SP) при длинах волн: возбуждение FITC 495 нм и излучение 519 нм; DAPI возбуждение 345 нм и излучение 455 нм. (B) Уровень миелопероксидазы (МПО) в гомогенатах ткани желудка морских свинок, неинфицированных или инфицированных H . pylori через 7 и 28 дней после инокуляции. (C) Уровень металлопротеиназы (MMP-9) в гомогенатах ткани желудка (i) или сыворотке (ii) морских свинок, неинфицированных или инфицированных H . pylori через 7 и 28 дней после инокуляции. Были исследованы пять животных в группе для контроля и по 5 животных в группе для инфицированных особей (через 7 и 28 дней после инокуляции, n = 5 + 5). Результаты представлены в виде средних значений с диапазоном из четырех независимых экспериментов, выполненных в трех экземплярах для каждого экспериментального варианта. Статистический анализ проводился с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Статистическая значимость * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 была получена для H . pylori инфицированных животных (через 7 и 28 дней после инокуляции) против контрольных животных; Н . pylori инфицированных животных через 7 дней против животных через 28 дней после последней инокуляции.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220636.g003

Из-за инфильтрации слизистой оболочки желудка нейтрофилами в течение H . pylori , мы оценили локальную и системную концентрации MMP-9 (рис. 3C). Эта матриксная металлопротеиназа доставляется в основном активированными гранулоцитами, ферментативная активность которых и секреция активных форм кислорода усиливают окислительный стресс в воспалительной среде, а также эпителиальными и эндотелиальными клетками в ответ на различные стимулы [62–63]. В нашем предыдущем исследовании (неопубликованные данные) мы показали корреляцию между повышенной концентрацией ММП-9 в сыворотке крови и H . pylori инфекция у взрослых пациентов с гастритом или ишемической болезнью сердца.В этом исследовании концентрацию MMP-9 оценивали в гомогенатах ткани желудка или в сыворотке H . pylori -инфицированные или неинфицированные морские свинки (рис. 3C i, ii). Он был значительно выше в ткани желудка инфицированных животных через 7 дней после инокуляции, чем у неинфицированных животных, и увеличивался еще через 28 дней после инокуляции. С другой стороны, уровень ММР-9 в сыворотке инфицированных животных значительно увеличился через 28 дней, тогда как через 7 дней он оставался на уровне контроля (неинфицированные животные) (рис. 3C ii). Наши результаты показывают, что уровень MMP-9 увеличивался сначала локально, а затем системно. MMP-9 катализирует нормальный оборот макромолекул внеклеточного матрикса (ECM) и может играть важную роль в процессах репарации. Это также подтвержденный проапоптотический фактор и регулятор клеточного цикла [64].

У человека, H . Инфекция pylori может изменять морфологию эпителиальных клеток, вызывая нарушение плотных контактов, индукцию продукции цитокинов, пролиферацию эпителиальных клеток и увеличение гибели эпителиальных клеток через апоптоз [65–66].В нашем исследовании мы использовали тест TUNEL, чтобы показать скорость апоптоза в слизистой оболочке желудка исследуемых животных. Наши результаты показали повышенное количество клеток, подвергающихся апоптозу, в слизистой оболочке желудка морских свинок, инфицированных H . pylori по сравнению с неинфицированными животными. Через 7 дней в желудочной ткани инфицированных животных было обнаружено больше апоптотических клеток, чем через 28 дней после инфицирования (рис. 4A i, ii), , что было совместимо с повышенной экспрессией антиапоптотического белка Bcl-xL в ткани желудка. через 28 дней (Рис. 4B i, ii) .Наше наблюдение апоптоза клеток в анализе TUNEL было дополнительно подтверждено обнаружением повышенного уровня расщепленной проапоптотической каспазы 3, который был более выраженным через 7 дней, чем через 28 дней (рис. 4C i, ii) . Тяжесть апоптотических изменений в ткани желудка может быть ответом на сильное воспаление, особенно во время острой фазы инфекции (в нашем исследовании, через 7 дней после последней инокуляции), чтобы защитить эпителий желудка от неблагоприятных последствий воспалительной реакции.Запрограммированная гибель клеток может уменьшить микробную инфекцию, отделить инфицированные клетки от неинфицированных и предупредить иммунную систему хозяина об опасных сигналах и повышении уровня медиаторов воспаления [67]. Апоптотические клетки могут индуцировать выработку противовоспалительных медиаторов, таких как трансформирующий фактор роста (TGF), простагландин E2 и фактор активации тромбоцитов макрофагами [68]. Многие факторы, включая инфекционные агенты и их компоненты, а также сигнальные белки нескольких сигнальных путей, активируемых во время процесса воспаления, участвуют в регуляции апоптоза клеток.Обычно клиренс апоптотических клеток макрофагами и эпителиальными клетками подавляет воспалительную реакцию; однако H . pylori демонстрируют способность снижать фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов с использованием различных стратегий [19–20, 69]. Это нарушение может приводить к нарушению клиренса апоптотических клеток и удлинению воспалительного ответа, что впервые было показано при заболеваниях легких [70]. Bimczok et al. [71] выявили, что эпителиальные клетки претерпевают апоптоз в ответ на живые H . pylori не элиминировались мононуклеарными фагоцитами желудка человека, даже несмотря на то, что они находились под влиянием TNF-α, высвобождаемого макрофагами и высоко экспрессируемого в H . pylor- инфицированной слизистой оболочки желудка по сравнению с контрольными клетками [71]. В настоящем исследовании интенсивная инфильтрация слизистой оболочки желудка H . pylori -инфицированные лимфоцитами животные могут указывать на их роль в апоптозе эпителиальных клеток желудка, что также предполагалось другими авторами [72–73].

Рис. 4. Интенсивность апоптоза и пролиферации в ткани желудка морских свинок, инфицированных H . пилори .

(A) Уровень апоптоза оценивали в ткани желудка морских свинок, неинфицированных или инфицированных H . pylori через 7 и 28 дней после инокуляции. (i) Интенсивность флуоресценции апоптотических клеток, обнаруженных в ткани желудка с помощью анализа TUNEL и окрашенных DAPI, измеряли с использованием программного обеспечения Image J версии 1.48v (Национальный институт здоровья, США). (ii) Репрезентативные изображения срезов ткани желудка, окрашенных с помощью анализа TUNEL, контрастированных с помощью DAPI и сфотографированных в флуоресцентном микроскопе (Axio Scope A1, Zeiss, Германия) при длинах волн: 550 нм (возбуждение) и 590 нм (излучение) для TUNEL и 345 нм (возбуждение), 455 нм (излучение) для DAPI. (B) Уровень интенсивности антиапоптотического действия Bcl-xL в ткани желудка морских свинок, неинфицированных или инфицированных H . pylori через 7 и 28 дней после инокуляции. (i) Интенсивность флуоресценции Bcl-xL в ткани желудка измеряли с использованием программного обеспечения Image J версии 1.48v (Национальный институт здравоохранения, США). (ii) Репрезентативные изображения Bcl-xL в ткани желудка, сфотографированные в конфокальном микроскопе (LeicaTCS SP). DAPI использовали для окрашивания ядер. (C) Уровень интенсивности расщепленной проапоптотической каспазы 3 (CC3) в ткани желудка морских свинок, неинфицированных или инфицированных H . pylori через 7 и 28 дней после инокуляции. (i) Интенсивность флуоресценции CC3 в ткани желудка измеряли с использованием программного обеспечения Image J версии 1.48v (Национальный институт здравоохранения, США). (ii) Репрезентативные изображения CC3 в ткани желудка, сфотографированные в конфокальном микроскопе (LeicaTCS SP). DAPI использовали для окрашивания ядер. (D) Уровень Ki-67 (маркер пролиферации) в ткани желудка морских свинок, неинфицированных или инфицированных H . pylori через 7 и 28 дней после инокуляции. (i) Клеточная пролиферация, выраженная как индекс мечения (LI%), указывающий на долю Ki-67-положительных клеток (коричневые меченые клетки) ко всем эпителиальным клеткам, подсчитанную с использованием программы Image J. (ii) Репрезентативные изображения ткани желудка, окрашенные на Ki67. Черные стрелки показывают положительные по Ki-67 клетки. Были исследованы пять животных в группе для контроля и 10 животных в группе для инфицированных особей (n = 5 + 5).Результаты представлены в виде средних значений четырех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах для каждого экспериментального варианта. Статистический анализ проводился с использованием непараметрических критериев U Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса. Статистическая значимость * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 была получена для H . pylori инфицированных животных (через 7 и 28 дней после инокуляции) против контрольных животных; Н . pylori инфицированных животных через 7 дней против животных через 28 дней после последней инокуляции.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220636.g004

Потеря эпителиальных клеток в ткани желудка в течение H . Инфекция pylori требует усиления пролиферативной активности эпителиальных клеток желудка. В этом исследовании белок Ki-67 был маркером пролиферации клеток в ткани желудка контрольных или инфицированных животных. Наши результаты показали, что эпителиальные клетки пролиферируют более интенсивно в хронической фазе инфекции, что свидетельствует о прорегенеративном потенциале этих клеток (рис. 4C i, ii) .Однако повышенная активность пролиферации эпителиальных клеток желудка в ответ на H . pylori может увеличивать риск мутаций, которые могут иметь отношение к развитию рака желудка [74].

Клеточное исследование – реакция на растворимые компоненты

Н . pylori бактерии являются источником множества растворимых или связанных с клеточной поверхностью вирулентных факторов, которые, связываясь с клетками-хозяевами, влияют на развитие болезни [22,75–76].Мы использовали первичные эпителиальные клетки желудка и фибробласты для изучения in vitro эффектов хорошо охарактеризованного H . pylori антигенов, таких как GE, CagA, UreA и LPS, при условии барьера эпителиальных клеток. Важно отметить, что оба типа клеток, использованных в экспериментах, были получены от морской свинки, что сделало модель более подходящей для модели in vivo для H . pylori , использованная в этом исследовании. Фибробласты, присутствующие в субэпителиальной слизистой оболочке, могут быть нацелены на H . pylori соединений, которые проникают через эпителиальные поражения или переносятся туда через эпителий [77]. Кроме того, фибробласты участвуют в процессе заживления ран и воспаления, отвечая на провоспалительные цитокины [78–79]. Наши результаты показали значительное увеличение 4HNE из-за перекисного окисления липидов в первичных эпителиальных клетках желудка, а также в фибробластах в ответ на стимуляцию H . pylori компоненты (рис. 5A i, ii и рис 5B i, ii) .Интересно, что уровень 4HNE в эпителиальных клетках желудка при стимуляции H . pylori LPS был почти таким же интенсивным, как и ответ на E . coli эндотоксин (положительный контроль). Более того, повышенное количество 4HNE в эпителиальных клетках желудка и фибробластах стимулировалось H . pylori LPS происходило параллельно с высвобождением MMP-9 в супернатанты культур (фиг. 5C i, ii), , что также может потенциально отражаться in vivo .Однако не было значительного различия в концентрации MMP-9 между неинфицированными клетками и клетками, обработанными GE, CagA или UreA. Это может означать, что in vivo в течение H . pylori , MMP-9 может доставляться иммунокомпетентными клетками, инфильтрирующими слизистую оболочку желудка, особенно гранулоцитами.

Рис. 5. Детерминанты окислительного стресса в первичных эпителиальных клетках желудка и фибробластах морских свинок.

Оценка окислительного стресса, основанная на продукции 4HNE, оцененной в первичных эпителиальных клетках желудка ( A) и фибробластах ( B), не леченных или обработанных в течение 24 часов H . pylori антигены: экстракт глициновой кислоты (GE) (10 мкг / мл), белок цитотоксин-ассоциированного гена A (CagA) (1 мкг / мл), субъединица уреазы A (Ure A) (5 мкг / мл) и H . pylori (Hp) или E . coli (Ec) липополисахарид (LPS) (25 нг / мл). (i) Интенсивность флуоресценции 4HNE в эпителиальных клетках или фибробластах, измеренная с использованием программного обеспечения Image J версии 1.48v (Национальный институт здравоохранения, США). (ii) Репрезентативные изображения первичных эпителиальных клеток желудка и фибробластов, окрашенные на 4HNE и сфотографированные в флуоресцентном микроскопе (Axio Scope A1, Zeiss, Германия).DAPI использовали для окрашивания ядер. Желтые стрелки показывают локализацию 4HNE в клетках. (C) Продукция MMP-9 первичными эпителиальными клетками желудка (i) и фибробластами (ii) в ответ на H . pylori соединений, обнаруженных с помощью анализа ELISA. Результаты представлены в виде средних значений четырех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах для каждого экспериментального варианта. Статистический анализ проводился с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни со значимостью * P <0.05, ** P <0,01, *** P <0,001 получено для нестимулированных клеток по сравнению с клеток, обработанных H . pylori антигенов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220636.g005

Наши результаты, полученные с помощью анализа TUNEL, показали повышенное количество первичных эпителиальных клеток желудка (Рис. 6A, i, ii) и фибробластов (Рис. 6B i, ii) претерпевают апоптоз в ответ на лечение GE, CagA, UreA или LPS H . pylori , а ЛПС показал самую сильную проапоптотическую активность, аналогичную E . coli LPS. В культурах, обработанных H . pylori LPS или стандартный E . coli LPS, апоптоз был необратим, что подтверждается конденсацией хроматина и распадом ядер клеток при окрашивании DAPI (фиг. 6A iii, iv и фиг. 6B, iii, iv). В подтверждение нашего наблюдения, что H . pylori Компоненты активировали апоптоз обоих типов клеток, что было обнаружено с помощью окрашивания TUNEL, мы проанализировали расщепленную проапоптотическую каспазу 3 (CC3) и Bax, а также антиапоптотическую экспрессию Bcl-xL и Bcl-2 в клетках.Как показано на рис. , рис. 7A i, ii, и , рис. 7B, i, ii, , экспрессия антиапоптотического Bcl-xL снижалась, тогда как экспрессия проапоптотического CC3 увеличивалась в эпителиальных клетках желудка и фибробластах, обработанных H. . pylori компонентов. Поскольку эпителиальные клетки желудка и фибробласты стимулируются с помощью H . pylori LPS высвобождает значительное количество MMP-9 в культуральную среду, и этот фермент является общепризнанным индуктором апоптоза клеток [64], мы изучили его роль в H . pylori -индуцированная регуляция выживаемости клеток. Добавление экзогенного ММР-9 к культурам эпителиальных клеток желудка и фибробластов, которое проводили с H . pylori , что привело к более интенсивной продукции CC3, снижению экспрессии антиапоптотического Bcl-xL ( Рис. 8A и 8B) и антиапоптотического белка Bcl-2, а также к повышенной экспрессии проапоптотического Bax белок (Фиг.9A и 9B) . Pierzchalski et al. [80] предложил жить только H . pylori бактерий были способны вызывать каспазо-3-зависимый апоптоз в эпителиальных клетках желудка. Наши результаты показали не только необратимый апоптоз эпителиальных клеток желудка и фибробластов при воздействии H . pylori LPS, но также сниженная пролиферативная активность клеток, измеренная в анализе восстановления МТТ и радиоактивном анализе (Фиг.10A и 1B ), и уменьшенная миграция клеток в анализе царапин, предполагая его роль в том, что клетки не могут восстанавливать повреждение. (Рис. 11A и 11B).

Рис. 6. Определение интенсивности апоптоза в эпителиальных клетках желудка и фибробластах, обработанных H . pylori компонентов.

Апоптоз клеток, оцениваемый с помощью анализа TUNEL, и ядерное окрашивание с помощью DAPI оценивали в культурах клеток первичных эпителиальных клеток желудка (A) и фибробластов ( B) , нестимулированных или стимулированных в течение 24 часов бактериальными антигенами: экстракт глициновой кислоты ( GE) (10 мкг / мл), белок цитотоксин-ассоциированного гена A (CagA) (1 мкг / мл), субъединица уреазы A (Ure A) (5 мкг / мл) и H . pylori (Hp) или E . coli (Ec) липополисахарид (LPS) (25 нг / мл). (i) Интенсивность флуоресценции первичных эпителиальных клеток и фибробластов, окрашенных в анализе TUNEL и подсчитанных с использованием программного обеспечения Image J версии 1.48v (Национальный институт здравоохранения, США). (ii) Репрезентативные изображения первичных эпителиальных клеток или фибробластов, окрашенных в анализе TUNEL (красные ядра), сфотографированные в флуоресцентном микроскопе (Axio Scope A1, Zeiss, Германия) при длинах волн: 550 нм (возбуждение) и 590 нм (эмиссия) . (iii) Процент первичных эпителиальных клеток и фибробластов, окрашенных DAPI и указывающих на повреждение ДНК. (iv) Типичные изображения первичных эпителиальных клеток и фибробластов, окрашенных DAPI (синие ядра) и сфотографированных в флуоресцентном микроскопе (Axio Scope A1, Zeiss, Германия) при длинах волн: 345 нм (возбуждение), 455 нм (излучение). Желтые стрелки показывают распад хроматина. Результаты представлены в виде средних значений четырех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах для каждого экспериментального варианта.Статистический анализ проводили в непараметрическом U-тесте Манна-Уитни со значимостью для * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, полученных для нестимулированных клеток по сравнению с клеток, обработанных H . pylori антигенов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220636.g006

Рис. 7. Bcl-xL и CC3 в эпителиальных клетках желудка и фибробластах, обработанных H . pylori компонентов.

Уровень антиапоптотического Bcl-xL и расщепленной проапоптотической каспазы 3 (CC3) в клеточных культурах первичных эпителиальных клеток желудка (A) и фибробластов (B) , нестимулированных или стимулированных в течение 24 часов бактериальными антигенами: глицином ацидный экстракт (GE) (10 мкг / мл), белок цитотоксин-ассоциированного гена A (CagA) (1 мкг / мл), субъединица уреазы A (Ure A) (5 мкг / мл), H . pylori (л.с.) и E . coli (Ec) липополисахарид (LPS) (25 нг / мл). Уровень интенсивности Bcl-xL (i) и CC3 (iii) в первичных эпителиальных клетках и фибробластах измеряли с использованием программного обеспечения Image J версии 1.48v (Национальный институт здравоохранения, США). Репрезентативные изображения первичных эпителиальных клеток и фибробластов, окрашенных на Bcl-xL (ii) и CC3 (iv) и сфотографированных в конфокальном микроскопе (LeicaTCS SP).DAPI использовали для окрашивания ядер и фаллоидин для окрашивания цитоскелета. Результаты представлены в виде средних значений четырех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах для каждого экспериментального варианта. Статистический анализ проводили в непараметрическом U-тесте Манна-Уитни со значимостью для * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, полученных для нестимулированных клеток по сравнению с клеток, обработанных H . pylori антигенов.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0220636.g007

Рис. 8. Bcl-xL и CC3 в клетках желудка при воздействии H . pylori компонентов и / или металлопротеиназы (ММП) -9.

Уровень антиапоптотического Bcl-xL и расщепленной проапоптотической каспазы 3 (CC3) в клеточных культурах первичных эпителиальных клеток желудка (A) и фибробластов (B) , нестимулированных или стимулированных в течение 24 часов с помощью экстракта глициновой кислоты (GE) (10 мкг / мл), MMP-9 (1 U– 7,5 нг / мл), MMP-9 (10 U– 75 нг / мл), MMP-9 (1 U– 7.5 нг / мл) + GE (10 мкг / мл) и MMP-9 (10 U– 75 нг / мл) + GE (10 мкг / мл). Уровень интенсивности Bcl-xL (i) и CC3 (iii) в первичных эпителиальных клетках и фибробластах измеряли с использованием программного обеспечения Image J версии 1.48v (Национальный институт здравоохранения, США). Репрезентативные изображения первичных эпителиальных клеток и фибробластов, окрашенных на Bcl-xL (ii) и CC3 (iv) и сфотографированных в конфокальном микроскопе (LeicaTCS SP). DAPI использовали для окрашивания ядер и фаллоидин для окрашивания цитоскелета.Результаты представлены в виде средних значений четырех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах для каждого экспериментального варианта. Статистический анализ проводили в непараметрическом U-критерии Манна-Уитни со значимостью * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, полученными для нестимулированных клеток по сравнению с клеток, обработанных H . pylori антигенов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220636.g008

Рис. 9. Bax и Bcl -2 в клетках желудка, подвергнутых воздействию H . pylori компонентов и / или металлопротеиназы (MMP-9).

Уровень проапоптотического Bax и антиапоптотического Bcl-2 в клеточных культурах первичных эпителиальных клеток желудка (A) и фибробластов (B) , нестимулированных или стимулированных в течение 24 часов: мкг / мл), MMP-9 (1 U– 7,5 нг / мл), MMP-9 (10 U– 75 нг / мл), MMP-9 (1 U– 7,5 нг / мл) + GE (10 мкг / мл ) и MMP-9 (10 U– 75 нг / мл) + GE (10 мкг / мл). Уровень интенсивности Bax (i) и Bcl-2 (iii) в первичных эпителиальных клетках и фибробластах измеряли с использованием программного обеспечения Image J версии 1.48v (Национальный институт здоровья, США). Репрезентативные изображения первичных эпителиальных клеток и фибробластов, окрашенных на Bax (ii) и Bcl-2 (iv) и сфотографированных в конфокальном микроскопе (LeicaTCS SP). DAPI использовали для окрашивания ядер и фаллоидин для окрашивания цитоскелета. Результаты представлены в виде средних значений четырех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах для каждого экспериментального варианта. Статистический анализ проводился с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни со значимостью * P <0.05, ** P <0,01, *** P <0,001 получено для нестимулированных клеток по сравнению с клеток, обработанных H . pylori антигенов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220636.g009

Рис. 10. Общий рост эпителиальных клеток желудка и фибробластов, подвергшихся воздействию H . pylori компонентов.

Общий рост первичных эпителиальных клеток желудка ( A) и фибробластов ( B) нестимулированных или стимулированных бактериальными антигенами: экстракт глициновой кислоты (GE) (10 мкг / мл), белок гена A, ассоциированного с цитотоксином (CagA) (1 мкг / мл), субъединица уреазы A (Ure A) (5 мкг / мл) и H . pylori (Hp) или E . coli (Ec) липополисахарид (LPS) (25 нг / мл), обнаруженный на основе включения ( ³ H) -тимидина в клеточную ДНК (i) или анализа восстановления МТТ (ii). (i) Пролиферация первичных эпителиальных клеток желудка или фибробластов показана в виде графика, представляющего индекс стимуляции (SI), рассчитанный путем деления количеств радиоактивности (имп / мин / мин) для культур клеток в присутствии стимула на подсчеты для контрольные культуры клеток только в культуральной среде.Результаты представлены в виде среднего значения с диапазоном. Приведены результаты шести независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах для каждого варианта эксперимента. (ii) Восстановление соли МТТ первичными эпителиальными клетками и фибробластами показано в виде графика, представляющего средний процент клеток (нестимулированных и стимулированных антигенами H . pylori ), способных снижать МТТ. Данные представляют собой средние значения четырех независимых экспериментов, выполненных в трех экземплярах для каждого экспериментального варианта.Статистический анализ проводили в непараметрическом U-тесте Манна-Уитни со значимостью для * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, полученных для нестимулированных клеток по сравнению с клеток, обработанных H . pylori антигенов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220636.g010

Рис. 11. Эффективность миграции эпителиальных клеток желудка и фибробластов, подвергшихся воздействию H . pylori компонентов.

Миграция первичных эпителиальных клеток желудка (A) и фибробластов (B) , нестимулированных или обработанных: экстракт глициновой кислоты (GE) (10 мкг / мл), белок цитотоксин-ассоциированного гена A (CagA) (1 мкг / мл), субъединица уреазы A (Ure A) (5 мкг / мл), H . pylori (Hp) или E . coli (Ec) липополисахарид (LPS) (25 нг / мл) и обнаружен в анализе царапин. (i) Миграция первичных эпителиальных клеток и фибробластов показана в виде графика, представляющего слияние раны [%] (средний размер раны в зависимости от времени). Результаты представлены в виде средних значений четырех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах для каждого экспериментального варианта. Статистический анализ проводился с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни со значимостью * P <0.05, ** P <0,01, *** P <0,001 получено для нестимулированных клеток по сравнению с клеток, обработанных H . pylori антигенов (в зависимости от используемых стимуляторов). (ii) Фазово-контрастные микроскопические изображения царапин. Снимки были сделаны в указанные моменты времени, и степень закрытия раны показана для каждого варианта лечения (красные стрелки). Показаны репрезентативные изображения каждой временной точки для обоих типов клеток.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0220636.g011

Ранее было показано, что патогенные эффекты H . pylori LPS были связаны с усилением экспрессии провоспалительных цитокинов слизистой оболочки желудка, избыточной продукцией оксида азота, снижением продукции регуляторных цитокинов и прекращением прогрессирования клеточного цикла и пролиферации клеток [45, 81–82]. Ли и др. [83] заметили, что LPS регулирует проапоптотическую экспрессию MMP-9 посредством передачи сигналов Toll-like (TLR) 4 / NF-κB, и Cho et al.[84] сообщили об индукции генов, связанных с апоптозом, в клетках карциномы человека с помощью H . pylori токсин VacA [83–84]. Этот токсин в основном секретируется H . pylori в желудочную среду; однако он также экспонируется на поверхности бактериальных клеток и присутствует в мембранных везикулах [76]. Ранее мы показали, что пролиферация лимфоцитов периферической крови человека ингибируется в присутствии антигенного комплекса из H . pylori G27 VacA + CagA-, но не из мутантного штамма G27 VacA-CagA- [85]. В настоящем исследовании эпителиальные клетки желудка и фибробласты стимулировались экстрактом глициновой кислоты из H . pylori CCUG 17874 VacA + CagA + штамм. Следовательно, возможно, что VacA может быть ответственным за определенные эффекты, продемонстрированные в этом исследовании. Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить участие VacA в регуляции MMP-9, а также в пролиферации и апоптозе эпителиальных клеток желудка.

В заключение, результаты, полученные с использованием модели in vivo морских свинок, экспериментально инфицированных H . pylori и in vitro клеточных моделей первичных эпителиальных клеток желудка морской свинки и фибробластов показали, что в течение H . pylori , растворимые факторы вирулентности этих бактерий, присутствующие в нише колонизации, могут вызывать апоптоз клеток и ингибирование пролиферации клеток в связи с воспалительным ответом и повышенным окислительным стрессом.Утрата клеток влияет на целостность и защитную функцию эпителиального барьера желудка. Н . pylori Компоненты потенциально могут проникать через желудочный барьер в базальную мембрану, где они могут влиять на прорегенеративную функцию фибробластов, поддерживая воспалительную реакцию и развитие патологических эффектов. Преодолевая барьеры из желудочной ткани, H . Компоненты pylori также могут влиять на иммунные клетки. Однако результаты клеточных экспериментов in vitro , в которых используются рекомбинантные белки, следует интерпретировать с осторожностью.Неясно, идентичны ли вызываемые ими эффекты эффектам, вызываемым живыми бактериями.

Наша группа и другие авторы ранее показали, что около H . pylori Компоненты , включая CagA или LPS, обладают отрицательными иммуномодулирующими свойствами, которые могут способствовать выживанию бактерий и длительной инфекции, что увеличивает риск язвенной болезни и развития рака [20, 23,43, 85–89]. Стоит подчеркнуть, что эффекты индивидуальные H . pylori компоненты могут быть разными. Следовательно, учитывая островную природу H . pylori , следует предположить, что соотношение между отдельными компонентами может иметь значительное влияние на их эффекты в месте колонизации. Сохранение воспалительной реакции вместе с одновременным увеличением скорости пролиферации эпителиальных клеток желудка может представлять риск неопластических изменений, особенно в воспалительной среде, вызванной H . pylori [90]. Транслокация H . pylori Соединения через пищеварительный тракт потенциально могут вызывать системные эффекты у хозяина в ответ на H . pylori инфекция.