противовоспалительное, болеутоляющее, спазмолитическое, успокаивающее, противомикробное, регенерирующее.

Микроклизмы с минеральной водой, отварами трав, ректальная инсуфляция с озоном.

Микроклизмы от запора – это универсальное средство обеспечения выхода каловых масс, подходящее для взрослых и детей. И несмотря на то, что вводится небольшой объем раствора, процедура имеет высокую эффективность и быстро выводит даже сухой и плотный кал.

Микроклизма – это способ введения в прямую кишку лечебного раствора или воды. В этом случае количество жидкости, требуемой для клизмирования, составляет 50-300 миллилитров, в отличие от обычных клизм.

Ректальная инсуфляция с озоном.

Этот метод считается одним из самых безопасных и используется в разных случаях. Многие считают, что ректальные инсуфляции не уступает по эффективности общей озонотерапии с внутривенным введением озонированного физиологического раствора. Чаще всего в прямую кишку вводится от 100 до 800 мл кислорода и озона.

Процесс занимает от 1,5 до 2 минут. Высокая эффективность доставки кислородно-озоновой смеси путем ректальной инсуфляции достигается несколькими уникальными свойствами толстой кишки, и в первую очередь с ее громадной поверхностью поглощения.

Принимая во внимание анатомические, иммунологические, биохимические и микробиологические особенности кишечника использование медицинского озона ректально применяют для: достижения значительного иммунологического эффекта благодаря прямому воздействию на самую большую лимфатическую систему организма; чтобы вызывать улучшения, связанные со всеми оксидативными процессами, в том числе происходящими в печени; способствовать улучшению микробиологической среды кишечной флоры. Этот метод эффективен и при лечении местных проблем: проктита и колита, свищей, геморроя, трещин, любых воспалительных процессах прямой кишки.

Применяются в санатории и грязевые ректальные тампоны. Механизм действия грязи на организм больного обусловлен механическим влиянием на толстую кишку массой грязи соприкосновения ее частиц, микроэлементов со слизистой кишки,температурой грязи.

Грязевое ректальное лечение оказывает противовоспалительное, обезбаливающее, антимикробное, рассасывающее действия.

Улучшает функции пораженного органа, чему способствует улучшение обменных процессов, крово-и лимфообращения.

Полезные советы и рекомендации врачей — Эс Класс Клиник Саратов

Посещение гинеколога

Рекомендации перед посещением гинеколога

Многие женщины не любят посещать гинеколога, не смотря на настоятельные рекомендации врачей делать это (если ни что не беспокоит, в профилактических целях) раз в год. Важно помнить, что врач гинеколог занимается не только лечением уже текущего заболевания, но  профилактикой развития заболеваний.

Итак, собираясь на прием к гинекологу, потратьте немного своего времени и вспомните такие важные для врача гинеколога моменты, как дату начала последней менструации, среднюю продолжительность вашего цикла, в каком возрасте у вас началась менструация. Эти вопросы обязательно будут заданы врачом и будет лучше, если вы будете знать на них ответ, так как находясь на приеме вспомнить некоторые подробности бывает сложно.  Старайтесь сделать так, чтобы ваш визит к гинекологу не попал на дни менструации, так как в этом случае врач не сможет взять у вас некоторые анализы и провести полноценный осмотр. А вот если кровянистые выделения вдруг появились в середине цикла или менструация не прекращается длительное время, то визит к врачу должен быть незамедлительным.

Гигиенические процедуры перед посещением врача обязательны, но будет лучше, если вы примите просто душ. Не нужно спринцеваться, использовать интимные дезодоранты или присыпки.

Если вы принимали антибиотики, то ваш визит к гинекологу лучше спланировать не раньше чем через 10-12 дней после того как закончили принимать лекарства. Перед визитом к гинекологу лучше воздержаться от половых контактов в течении суток.

Не дожидайтесь появления тревожных симптомов, для того, чтобы посетить гинеколога. Некоторые серьезные заболевания- опухоли той или иной локализации, рак шейки матки протекают бессимптомно в течении  длительного периода времени. Каждая женщина должна раз в год проходить профилактический гинекологический осмотр с забором цитологических мазков, которые как раз и позволяют выявить изменения в клетках тканей шейки матки и вовремя пройти лечение, способное предотвратить процесс развития раковых опухолей. И проведением УЗИ –  эта диагностика позволяет визуализировать те образования, которые недоступны для исследования при проведении обычной пальпации, оценить состояние полости матки, яичников.

Современная гинекология позволяет не только диагностировать на ранних стадиях серьезные заболевания, но и помочь женщинам, у которых наступил климактерический период. Большой шаг сделан в лечении бесплодия и в вопросах контрацепции.

Не откладывайте визит к врачу на завтра. Здоровье бесценно. Начните заботиться о себе- пройдите профилактический прием у гинеколога.

Микроклизма с лекарственными веществами – Санаторий «Алмед»

Описание

Микроклизма – способ очищения организма от шлаков и токсинов, способствующий восстановлению кровообращения и нормализации работы кишечника и органов малого таза.

Микроклизмы с лекарственными веществами назначают при нарушениях работы и воспалениях кишечника, при патологии дистального отдела толстой кишки (эрозии, язве, геморрогическом проктите и т.д.), метеоризме, наружном и внутреннем геморрое (можно делать даже при кровоточащих узлах), при болях в суставах и нижних отделах позвоночника, при нарушении менструального цикла, при дерматологических проблемах, при снижении иммунитета и упадке сил. Процедура обладает мягким терапевтическим действием и оказывает болеутоляющий, успокаивающий, противовоспалительный, противомикробный, ранозаживляющий эффект.

Отличие лечебных микроклизм от принятия пероральных препаратов в том, что усвоение нужных веществ происходит быстрее за счет высокой всасывающей способности слизистой оболочки кишечника, что, в свою очередь, повышает эффективность проводимого лечения.

Противопоказаниями к проведению лечебных микроклизм являются острые воспалительные процессы, сопровождающиеся повышением температуры тела, кровотечения, опухоли органов желудочно-кишечного тракта.

Для достижения максимального лечебного эффекта и для улучшения всасывания лекарственных препаратов перед проведением микроклизм необходимо провести очистительную клизму.

Процедура кажется малоприятной, но на самом деле сильного дискомфорта она не доставит – лекарственный раствор нагревают до комфортной температуры и используют небольшой объем – всего около 100 мл. После введения, лекарство удерживается в кишечнике от 10 до 40 минут и затем выводится естественным путем. Предпочтительное время для проведения процедуры – утром натощак или вечером перед сном.

Благодаря лечебным микроклизмам проходят болевые синдромы, улучшается состояние кожи, повышается настроение, организм очищается от вредных веществ.

Подготовка к операциям и исследованиям — Больница Pacific

Что может понадобится при госпитализации?

Каждый случай – индивидуален, и каким образом вы будете готовиться к своему пребыванию в больнице Pacific, зависит от назначенного лечения или показанной операции. Мы заранее подготовим для вас информацию о предстоящей операции, лечении или обследовании, а так же дату госпитализации.

Если вам назначается общий наркоз, категорически запрещено употреблять алкогольные напитки за день до визита к нам, а если вы курите, вам следует отказаться от курения.

Если вы простыли, у вас заболело горло или появились другие признаки недомогания, незамедлительно сообщите нам об этом, поскольку ваша госпитализация, возможно, будет перенесена на другую дату.

Возьмите с собой следующие предметы:

• ночная рубашка или пижама;
• тапочки;
• лекарства, которые вы уже принимаете;
• книги или журналы;
• туалетные принадлежности, в т.ч. зубная щетка, зубная паста, щетка для волос или расчески;
• по желанию: вы можете взять с собой все, что может потребоваться для комфортного пребывания в больнице, но не будет беспокоить окружающих.

Просим не приносить с собой ценные предметы, ювелирные украшения или крупные суммы денег.

Также просим Вас ознакомиться с Правилами внутреннего распорядка для потребителей услуг.

Что нужно делать по возвращении домой?

Мы обязательно сообщим вам примерную дату выписки; тогда вы сможете договариваться о встречах со своими друзьями и больше проводить времени со своими членами семьи.

Ваш лечащий врач даст вам рекомендации, которые вы должны будете соблюдать дома, а также сообщит вам время следующего приема врача или расскажет об особенностях лечения дома. Если для вашего выздоровления вам нужно пить лекарства, вам выдадут эти лекарства перед выпиской из больницы.

В первые сутки после выписки рекомендовано постоянное присутствие родственников или близких для наблюдения за пациентом или экстренного вызова специалистов.

Когда вы вернетесь домой, рекомендуем:

• как можно меньше перетруждаться и больше отдыхать;
• принимать лекарства точно по назначению вашего лечащего врача;
• строго выполнять все указания, которые вы получили при выписке: сюда входят все рекомендации по поводу того, что можно есть и когда можно начинать физическую активность – садиться за руль или поднимать тяжести.

При возникновении вопросов звоните в частную больницу Pacific по телефону круглосуточного контакт-центра.

Как подготовиться к гастроскопии и колоноскопии?

У детей гастроскопия проводится с 5 лет. Анестезия, используемая при проведении исследований – потенцирование (седация) – это внутривенная анестезия длительностью примерно 30 мин.

Как подготовиться к магнитно-резонансной томографии (МРТ)?

Важно! При записи необходимо учитывать время проведения исследования! Просьба приезжать на 10 мин раньше для оформления карты и подготовки к исследованию.

Кашель и заложенный нос могут существенно влиять на качество исследования (пациент должен быть неподвижен во время всего исследования).

Пациенты с пластинами после травм принимаются на исследования ТОЛЬКО с сертификатами на пластину или с выпиской из истории болезни.

АБСОЛЮТНЫЕ ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ:

• наличие кардиостимулятора;
• любые вживленные имплантаты с наличием батареи питания;
• некоторые виды сердечных клапанов;
• клипсы на сосудах головного мозга;
• беременность до 13-14 недель.

Как подготовиться к ультразвуковому исследованию (УЗИ)?

микрокластеров TCR образуют пространственно сегрегированные домены и последовательно собираются в кальций-зависимых кинетических этапах

Пространственно сегрегированные домены в микрокластерах TCR

Поскольку некоторые микрокластеры TCR меньше дифракционного предела (~ 250 нм) обычных световых микроскопов, в предыдущих исследованиях использовалось Методы SMLM для более глубокого понимания структуры и состава микрокластеров. На сегодняшний день исследования SMLM выявили закономерности сборки молекул внутри микрокластеров, наноразмерную кластеризацию молекулярных компонентов и трехмерное распределение концентрированных рецепторов в покоящихся Т-клетках ^13,14,25 .Однако, в дополнение к ограничениям SMLM, упомянутым выше, мы и другие сообщили об артефакте кластеризации фотоактивируемых флуоресцентных белков, используемых в SMLM ^26,27 , и плохом разрешении в методах SMLM на основе антител из-за неадекватной маркировки целевых структур ^{16, 28,29} . Учитывая эти проблемы, мы стремились использовать TIRF-SIM, который дает разрешение ~ 100 нм и совместим с хорошо охарактеризованными мономерными флуоресцентными белками для выполнения живых изображений формирования микрокластеров в Т-клетках ³⁰ .

Т-клетки Jurkat, экспрессирующие TCRζ-Halo, конъюгированные с лигандом Janelia Fluor 646 (JF646) и ZAP70-Emerald, активировали на стекле, покрытом анти-CD3ε, и отображали с использованием TIRF-SIM. Сигналы TCRζ-Halo и ZAP70-Emerald совместно локализованы в каждом микрокластере (рис. 1а), как и ожидалось, исходя из известного связывания ZAP70 с остатками TCRζ ITAM. В отличие от TCRζ, LAT-Halo-JF646 и SLP76-Halo-JF646 были отделены от ZAP70-Emerald, но прилегали к нему на изображениях TIRF-SIM активированных клеток Jurkat (рис.1б, г). Такая же картина наблюдалась между эндогенными TCRζ и LAT в отдельных микрокластерах (рис. 1c). В активированных клетках Jurkat, экспрессирующих GADS-Emerald, ZAP70-Apple и GRB2-Halo-JF646 или LAT-Emerald, ZAP70-Apple и SLP76-Halo-JF646, наблюдалась совместная локализация между адапторными молекулами (GADS и GRB2, LAT и SLP76), но отделены от ZAP70 (Fig. 1e-f), показывая, что субдомен существует пространственно отличным от TCR и ZAP70 внутри микрокластеров. Другие сигнальные молекулы, связанные с LAT-комплексом, ADAP, NCK и VAV1 также локализованы в этой сегрегированной области, смежной с ZAP70 (дополнительный рис.1), указывая на то, что субдомен представляет собой олигомеризованный сигнальный комплекс LAT. Эти наблюдения показывают, что в микрокластерах существуют два пространственных домена субдифракционного размера: один отмечен TCR и ZAP70, а другой – ассоциированным с LAT адаптером и сигнальными молекулами, которые мы будем называть рецепторными и сигнальными доменами.

Визуализация микрокластеров TIRF-SIM показывает различные домены рецептора и сигнальные домены. TIRF-SIM-изображения микрокластеров, сформированных в Т-клетках Jurkat, активированных на связанных с покровным стеклом антителах к CD3, визуализировали с использованием a TCRζ-Halo-JF646 (красный) и ZAP70-Emerald (зеленый), b ZAP70-Emerald (зеленый ) и LAT-Halo-JF646 (красный), c анти-pTCRζ Y142; красный) и анти-pLAT (Y226; зеленый), d ZAP70-Emerald (зеленый) и SLP76-Halo-JF646 (красный), e GADS-Emerald (зеленый), ZAP70-Apple (красный) и GRB2 -Halo-JF646 (синий) и f LAT-Emerald (синий), ZAP70-Apple (красный) и SLP76-Halo-JF646 (зеленый). a – f Верхнее правое изображение было увеличено из области, отмеченной белым прямоугольником на левом изображении, а нижний правый график показывает относительную (отн.) Интенсивность, измеренную по ширине белой линии в соответствующем верхнем правом углу. изображение. a – f Масштабные полосы на левых изображениях, 4 мкм

Пошаговое включение компонентов микрокластера TCR

В дополнение к пространственно различающимся доменам микрокластера, покадровые изображения TIRF-SIM выявили поразительную закономерность в динамике TCR образование микрокластера.Мы постоянно наблюдали задержку в появлении ZAP70 во вновь сформированных периферических кластерах TCRζ и LAT или SLP76 в периферических кластерах ZAP70 (Fig. 1a-d; Supplementary Movies 1-3). Эти наблюдаемые нестохастические задержки были неожиданными с учетом текущих моделей «сшивания» и «белкового острова», которые предсказывают стохастический процесс, управляемый взаимодействиями между связанными с мембраной молекулярными комплексами. Чтобы лучше охарактеризовать кинетику рекрутирования молекул в микрокластеры TCR, мы стремились замедлить образование микрокластеров, активируя клетки на покровных стеклах, покрытых анти-CD3ε, при комнатной температуре (21 ^o ° C) и визуализировали клетки с помощью микроскопии TIRF.Как и ожидалось, активированные клетки Jurkat, коэкспрессирующие CD3ε-YFP и TCRζ-Halo-JF646, показали одновременное рекрутирование обоих интегральных компонентов TCR в микрокластеры (Рис. 2a, f [TCRζ-CD3ε]). Напротив, на покадровых изображениях TIRF наблюдались большие задержки между рекрутированием ZAP70-Apple в TCRζ-Emerald, Grb2-Emerald в ZAP70-Apple и c-Cbl-YFP в ZAP70-Apple в отдельных микрокластерах (рис. 2b). –Д). Количественная оценка интенсивности флуоресценции показала кинетическое запаздывание ~ 27 с в рекрутинге ZAP70 до TCRζ и GRB2 для ZAP70 и большее кинетическое запаздывание ~ 40 с в рекрутинге c-Cbl в ZAP70 (рис.2е).

Компоненты микрокластера собираются в отдельные последовательные этапы. TIRF-изображения микрокластеров, сформированных в Т-клетках Jurkat, активированных на связанном с покровным стекле антителе к CD3 при 21 ^o ° C, были визуализированы с использованием a CD3ε-YFP (зеленый) и TCRζ-Halo-JF646 (красный), b TCRζ -Изумруд (зеленый) и ZAP70-Apple (красный), c ZAP70-Ruby (красный) и GRB2-Emerald (зеленый), d TCRζ-Halo-JF646 (пурпурный), ZAP70-Apple (красный) и GRB2-Emerald (зеленый) или e ZAP70-Apple (красный) и c-Cbl-CFP (зеленый). a – e Покадровый монтаж при 3 с / кадр (в центре) и график относительной интенсивности (внизу) области в рамке на верхнем изображении показывает кинетическую задержку между набором компонентов микрокластера. На нижнем графике показан график относительной интенсивности за полученный временной интервал в виде цветного круга и наиболее подходящая сигмоидальная кривая в виде цветной линии. Шкалы бруски, 2 мкм. f Среднее кинетическое отставание, наблюдаемое между набором соответствующих компонентов микрокластера. Кинетическое запаздывание измеряли путем вычисления разницы в половине максимума наиболее подходящих сигмоидальных кривых.* р <0,0001. г Кинетические задержки, измеренные между TCRζ-Emerald и ZAP70-Apple (красный) или ZAP70-Apple и GRB2-Emerald (синий) в клетках Jurkat, активированных на антителе, связанном с покровным стеклом, при указанных температурах. ч – j TIRF-изображения микрокластеров, сформированных в первичных человеческих CD3 ⁺ Т-клетках, активированных на связанных с покровным стеклом анти-CD3 и анти-CD28 антителах при 37 ° C, были визуализированы с использованием ч TCRζ-Emerald (зеленый) и ZAP70-Scarlet (красный), и ZAP70-Emerald (зеленый) и GRB2-Scarlet (красный).Покадровый монтаж с частотой 3 с / кадр (в центре) и график относительной интенсивности с наиболее подходящей сигмоидальной кривой (внизу) области в рамке на верхнем изображении. Масштабные линейки, 2 мкм. j Средние кинетические задержки (измеренные, как указано выше), наблюдаемые между рекрутированием соответствующих компонентов микрокластера

Дискретные, последовательные кинетические задержки также наблюдались в TCRζ-Halo-JF646, ZAP70-Apple и GRB2-, тройно экспрессирующими Т-клетками Jurkat. Изумруд (рис. 2г). Переключение тегов флуоресцентных белков на ZAP70 и GRB2 не повлияло на их кинетическое отставание (дополнительный рис.2A, p > 0,05), а кинетическая задержка между TCRζ-GRB2 равнялась комбинированным кинетическим задержкам между TCRζ-ZAP70 и ZAP70-GRB2 (дополнительный рис. 2B, p > 0,05), показывая, что несколько задержек в пополнении не зависели от выбора меченого флуоресцентного белка или комбинации микрокластерных молекул, используемых для его измерения. Кинетические задержки между TCRζ-ZAP70 и ZAP70-GRB2 зависели от температуры, хотя кинетическая задержка ZAP70-GRB2, по-видимому, стабилизировалась на ~ 15 с выше 30 ° C (рис.2г). Временная зависимость TCRζ-ZAP70 и части кинетических лагов ZAP70-GRB2 согласуется со стохастической природой белок-белковых взаимодействий. Однако временная независимость кинетических лагов ZAP70-GRB2 при более высоких температурах удивительна и, возможно, связана с предпочтительным кластеризацией LAT в специализированных мембранных доменах ³¹ или с фазовым разделением сшитых олигомеров LAT ¹² , с предположение, что сегрегация липидных доменов и фазовое разделение происходят селективно при более высоких температурах.Мы отмечаем здесь разницу в кинетических лагах между TCRζ-ZAP70 и ZAP70-GRB2 при комнатной температуре (~ 27 с) и при 37 ° C (~ 10 с), предположительно при температуре, при которой проводилось большинство предыдущих исследований. Взятые вместе, приведенные выше результаты предоставляют доказательства нестохастического, ступенчатого привлечения киназы ZAP70 в TCR с последующим привлечением сигнальных белков Grb2, а затем c-Cbl в TCR, связанный с ZAP70.

Чтобы убедиться, что ступенчатое привлечение компонентов микрокластера также наблюдалось в нетрансформированных клетках, мы адаптировали анализ к первичным Т-клеткам человека.Клетки CD3 ⁺ очищали и размножали из периферической крови человека и трансфицировали либо TCRζ-Emerald и ZAP70-Scarlet, либо ZAP70-Emerald и Grb2-Scarlet. Затем трансфицированные клетки наносили на стимулирующие покровные стекла, покрытые анти-CD3 и анти-CD28 антителами, и визуализировали при 37 ° C. Как наблюдали в клетках Jurkat, первичные бласты Т-клеток человека демонстрировали задержки в покадровых изображениях TIRF между рекрутированием ZAP70-Scarlet в TCRζ-Emerald и Grb2-Scarlet в ZAP70-Emerald (рис.2h, i). Количественная оценка интенсивности флуоресценции показала кинетическое запаздывание ~ 17 с в рекрутинге ZAP70 в TCRζ и ~ 12 с у GRB2 в рекрутинг ZAP70 (рис. 2j). Таким образом, хотя кинетика немного отличается от того, что мы наблюдали в клетках Jurkat, поэтапное привлечение микрокластерных белков было подтверждено в первичных лимфобластах человека при физиологической температуре.

Одновременное привлечение молекул сигнального домена

При запуске TCR мотивы фосфотирозина LAT служат сайтами связывания для белков, содержащих домен Sh3, включая PLCγ1, Grb2 и Gads.Gads набирает адаптер SLP-76 на LAT, а SLP-76, в свою очередь, набирает NCK, ADAP и VAV1 ^1,2 . Изображения TIRF-SIM показали, что сигнальный домен содержит LAT и эти LAT-ассоциированные адаптеры и ферменты. Чтобы проверить, следуют ли молекулы сигнального домена ступенчатому паттерну, наблюдаемому между последовательным рекрутированием TCRζ, ZAP70, GRB2 и c-Cbl, мы проанализировали кинетику рекрутирования молекул сигнального домена относительно ZAP70 или GRB2 в отдельных микрокластерах. В клетках Jurkat, коэкспрессирующих ZAP70-Apple и LAT-Emerald или SLP76-Emerald, кинетические задержки, измеренные между привлечением LAT к ZAP70 и SLP76 к ZAP70, были той же величины (~ 27), что и между ZAP70-GRB2, что позволяет предположить, что LAT, SLP76 и GRB2 одновременно рекрутируются в микрокластеры, отмеченные ZAP70 (рис.3a – e; p > 0,05). В соответствии с одновременным привлечением адаптерных молекул LAT, SLP76 и GRB2, совместная экспрессия PLCγ1-CFP, GADS-YFP и GRB2-Apple или SLP76-CFP, NCK-YFP и GRB2-Apple показала совпадающее появление PLCγ1, GADS, GRB2, SLP76 и NCK на отдельных микрокластерах (рис. 3в, г). Более того, в отличие от больших кинетических лагов, наблюдаемых между ZAP70-GRB2 или GRB2-cCbl, между GRB2 и PLCγ1, GADS, NCK, SLP76, VAV1 или ADAP кинетические задержки практически не наблюдались (рис.3e, p <0,05 по сравнению с ZAP70-GRB2 или GRB2-cCbl), что указывает на то, что LAT-ассоциированные адаптеры и ферменты привлекаются к сигнальному домену одновременно. В целом, эти результаты показывают, что тогда как формирование сигнального домена задерживается по сравнению с рецепторным доменом, компоненты сигнального домена рекрутируются одновременно во время его образования, что согласуется с высоко кооперативным характером белок-белковых взаимодействий ¹⁰ .

Компоненты сигнального кластера набираются одновременно в микрокластеры.TIRF-изображения микрокластеров, сформированных в Т-клетках Jurkat, активированных на связанном с покровным стекле антителе к CD3 при 21 ^o ° C, были визуализированы с использованием a LAT-Emerald (зеленый) и ZAP70-Apple (красный), b SLP76-Emerald (зеленый) и ZAP70-Apple (красный), c PLCγ1-CFP (пурпурный), GADS-YFP (желтый) и GRB2-Apple (голубой) или d SLP76-CFP (пурпурный), NCK-YFP (желтый) и GRB2-Apple (голубой). a – d Покадровый монтаж (в центре) и график относительной интенсивности (внизу) области, выделенной рамкой на верхнем изображении, показывают одновременное привлечение компонентов сигнального кластера.На нижнем графике показан график относительной интенсивности за полученный временной интервал в виде цветного круга и наиболее подходящая сигмоидальная кривая в виде цветной линии. Шкалы бруски, 2 мкм. e Среднее кинетическое отставание, наблюдаемое между рекрутированием указанной пары компонентов микрокластера при 21 ° C. n.s., не имеет значения. * p <0,0001 по сравнению с ZAP70-GRB2. ** p <0,0001 по сравнению с кинетическими задержками от GRB2-PLCγ1 к GRB2-ADAP

Две разные скорости диссоциации сигнальных доменов

Поскольку сигналы Т-клеток должны строго регулироваться, мы исследовали, регулируются ли сигнальные свойства микрокластеров динамически. путем диссоциации сигнальных молекул.Предыдущие исследования сообщили о быстром исчезновении сигнальных молекул в микрокластерах из-за убиквитинилирования LAT с помощью E3 ligase c-Cbl, что приводит к интернализации и деградации сигнального комплекса LAT ^19,32 . В соответствии с этими результатами, мы наблюдали короткую кинетическую задержку между рекрутированием Grb2 и c-Cbl, которая визуально заметна между красной (Grb2) и зеленой (c-Cbl) кривыми во время фазы пополнения (рис. 4a, левая часть графика до тех пор, пока ~ 100 с). Более того, пик в сигнале c-Cbl-YFP совпал с пиком Grb2-Apple, после чего наблюдалось быстрое затухание обоих сигналов (рис.4a справа от графика после черной стрелки), указывая тем самым, что рекрутирование c-Cbl ведет к разборке сигнального домена. Более того, поскольку отсроченное рекрутирование c-Cbl в связанные с GRB2 микрокластеры было показано здесь и на предыдущих рисунках (рис. 2e, f, 3e), кинетическая задержка GRB2-c-Cbl, вероятно, представляет собой временное окно между активной передачей сигналов и сигналом. затухание на отдельных микрокластерах. Здесь стоит отметить, что кинетическое отставание между ZAP70-c-Cbl (рис. 2e, f) эквивалентно объединенному лагу между ZAP70-GRB2 и GRB2-c-Cbl (рис.3д).

Диссоциация сигнального домена совпадает с рекрутированием c-Cbl и происходит с двумя разными скоростями. изображение TIRF микрокластеров, сформированных в Т-клетках Jurkat, активированных на связанном с покровным стекле антителе против CD3 при 21 ° C, визуализировали с использованием c-Cbl-YFP и GRB2-Apple. Покадровый монтаж (в центре) и график относительной интенсивности (внизу) области в рамке на верхнем изображении показывают уменьшение сигнала GRB2 и c-Cbl, совпадающее с пиком набора c-Cbl (черная стрелка).Шкала 2 мкм. b – d Типичные графики относительной интенсивности b PLCγ1-CFP (синий), GADS-YFP (зеленый) и GRB2-Apple (красный) или c SLP76-CFP (синий), NCK- YFP (зеленый) и GRB2-Apple (красный) или d SLP76-CFP (синий), Vav1-YFP (зеленый) и GRB2-Apple (красный) на микрокластерах. Цветные стрелки указывают конечные уровни интенсивности после диссоциации каждого соответствующего компонента сигнального кластера

В то время как молекулы сигнального домена появляются одновременно в индивидуальных микрокластерах, мы обнаружили различия в скорости их диссоциации.Различия в скоростях диссоциации наблюдались между тремя основными сигнальными молекулами, связанными с LAT фосфотирозинами: Gads, Grb2 и PLCγ1. В то время как сигнал GADS-YFP быстро снижался, сигналы PLCγ1-CFP и Grb2-Apple демонстрировали более медленную кинетику диссоциации (рис. 4b). Подобно Gads, наблюдалось более быстрое затухание сигналов связанного с Gads белка SLP-76 и связанного с SLP-76 NCK и VAV1, что указывает на то, что молекулы сигнальных доменов подвергаются быстрой и медленной скорости диссоциации от микрокластеров (рис.4в, г). Разница в скоростях диссоциации может быть результатом ускоренного удаления комплекса SLP76 из микрокластеров из-за сил притяжения со стороны присоединенной актиновой сети ^33,34 , различных скоростей убиквитинилирования или различных скоростей дефосфорилирования тирозина различными наборами фосфатаз.

Рекрутирование сигнального домена ведет к эффекторной функции

Сигнальный комплекс LAT необходим для амплификации передачи сигналов TCR и инициирования нижестоящих путей активации Т-клеток, включая внутриклеточный поток кальция и управляемое полимеризацией актина распространение клеток ¹ .Чтобы наблюдать последовательность этапов передачи сигналов нижестоящих TCR относительно образования микрокластеров, мы измерили общую интенсивность сигнала в синапсе в Т-клетке Jurkat, загруженной Fluo-4-AM и экспрессирующей ZAP70-Apple, и, как компонент сигнального домена, GRB2-Halo. Мы наблюдали ступенчатое привлечение ZAP70-Apple и GRB2-Halo-JF646 к микрокластерам с последующим инициированием потока кальция (рис. 5а, дополнительный фильм 4). Мы отмечаем здесь резкий вертикальный всплеск внутриклеточного потока кальция на фоне постепенного увеличения интенсивности GRB2, который, вероятно, отражает пересечение критического порога рекрутирования сигнального комплекса, необходимого для инициирования события потока кальция.Сходным образом, инициация быстрого распространения клеток наблюдалась после рекрутирования GRB2 в микрокластеры, что показано кимографией активированной клетки, экспрессирующей Zeta-Halo-JF646 и GRB2-Emerald (Fig. 5b, Supplementary Movie 5). Предыдущие исследования, изучающие функцию сигнального комплекса LAT, использовали LAT-дефицитную клеточную линию J.CaM2.5, которая может нести дополнительные генетические изменения в результате химического мутагенеза и, как сообщается, содержит остаточную экспрессию LAT ^19,35 . Поэтому мы стремились повторно изучить приток кальция и распространение клеток, а также проанализировать кинетику образования микрокластеров в линии клеток Jurkat с нокаутом LAT, генерируемой CRISPR, J.ЛАТ КО ³⁶ . Отсутствие LAT в клетках J.LAT KO подтверждали с помощью вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции (дополнительные фиг. 3A, C). Важно отметить, что приток кальция не был обнаружен в активированных клетках J.LAT KO, фенокопировавших клетки J.CaM2.5 (дополнительный рис. 3B). Однако, в то время как сигнал фосфо-LAT (pLAT) не наблюдался в стимулированных клетках J.LAT KO, низкие количества сигнала pLAT сохранялись в клетках J.CaM2.5 (дополнительный рис. 3C), что подтверждает пригодность клеток J.LAT KO для функциональных исследований. LAT.

Рекрутирование сигнального кластера необходимо для перехода к событиям активации Т-лимфоцитов ниже по течению. a Покадровая съемка (слева) Т-клетки Jurkat, активирующейся на связанном с покровным стекле антителе против CD3 при 21 ° C, экспрессирующем ZAP70-Apple (желтый), GRB2-Halo-JF646 (пурпурный) и Fluo-4 (голубой), и соответствующий график интенсивности во времени (справа) показывает, что поток кальция ниже по течению следует за рекрутированием сигнального кластера, как сообщает GRB2-Halo-JF646. b Справа, кимограф TCRζ-Halo-JF646 и GRB2-Emerald в активирующей Т-клетке Jurkat, соответствующей белой линии на левом TIRF-изображении, показывает, что распространение клеток начинается после набора сигнального кластера (белая стрелка на объединенном изображении). c Типичные изображения TIRF TCRζ-Emerald, ADAP-GFP, SLP76-CFP, GADS-YFP, VAV1-YFP, PLCγ1-CFP, NCK-YFP, GRB2-Emerald, c-Cbl-CFP, локализованные в активированном E6.1 Ячейки Jurkat (вверху) или с ZAP70-Apple или GRB2-Apple в активированных ячейках J.LAT KO (LAT ^{– / –} ) Jurkat. Типичные графики относительной интенсивности d TCRζ-Emerald (зеленый) и ZAP70-Apple (красный), e ZAP70-Apple (красный) и GRB2-Emerald (зеленый) или f c-Cbl-YFP и GRB2 -Apple в микрокластерах и г Среднее кинетическое отставание , измеренное между указанной парой компонентов микрокластера в J.LAT KO клетки. ч. Активированные клетки E6.1 и J.LAT KO Jurkat, коэкспрессирующие TCRζ-Halo-JF646 и mEmerald-WAVE1. i Типичные кимограммы TCRζ-Emerald в активированной клетке E6.1 и J.LAT KO Jurkat. Масштабные линейки, 2 мкм

Хотя TCRζ, ADAP, SLP76, GADS, VAV1, PLCγ1, NCK, GRB2 и c-Cbl локализованы в микрокластерах в клетках Jurkat E6.1, только сигналы TCRζ, GRB2, NCK и c-Cbl были очевидны на микрокластерах, меченных ZAP70, в клетках J.LAT KO с частичной локализацией NCK (рис.5в). Остаточная локализация GRB2, c-Cbl и NCK в микрокластерах в отсутствие LAT, возможно, связана с их известным взаимодействием с TCRζ, ZAP70 и CD3ε ^37,38,39 . Несмотря на отсутствие функционального сигнального домена, как определено выше, кинетические задержки TCRζ-ZAP70, ZAP70-GRB2 и GRB2-cCbl не были затронуты в клетках J.LAT KO (рис. 5d-g, p <0,05 по сравнению с E6 .1). Принимая во внимание, что мультивалентное сшивание LAT, как полагают, управляет общим образованием микрокластеров ^10,12 , эти результаты несколько удивительны и указывают на то, что образование рецепторного домена может быть независимым от сшивания LAT.Кроме того, молекулы, которые могут быть напрямую задействованы в белках рецепторного домена (GRB2, c-Cbl и NCK), могут обходить механизм поперечного сшивания LAT.

Семейство белков WASP играет важную роль в связывании передачи сигналов TCR с полимеризацией F-актина ³³ . В частности, член семейства WASP, WAVE / Scar, является критическим для ARP2 / 3-управляемой полимеризации F-актина после активации TCR, что приводит к быстрому радиальному росту ламеллиподов в T-клетках ^33,40,41 . Из трех изоформ мы выбрали WAVE1 из-за его селективной локализации на переднем крае ламеллиподий ⁴² , чтобы сообщить об экспансии клеток, управляемой ARP2 / 3, в активированных Т-клетках.В то время как mEmerald-WAVE1 сильно локализуется на переднем крае стимулированных клеток E6.1, WAVE1 не обнаруживается на периферии клеток в клетках J.LAT KO (рис. 5h), что соответствует ключевому требованию комплекса LAT в F-актине. распространение клеток, вызванное полимеризацией. Кроме того, быстрое распространение клеток не наблюдалось в стимулированных клетках J.LAT KO (фиг. 5i), несмотря на нормальную кинетику рекрутирования TCRζ, ZAP70, GRB2 и c-Cbl в микрокластеры (фиг. 5g). В совокупности эти результаты показывают, что LAT необходим для образования функционального сигнального домена и для перехода к нижестоящим путям активации Т-клеток.

Кинетическое отставание в рекрутировании микрокластеров зависит от кальция

Активация Т-клеток начинается с образования микрокластеров в очаговых контактах между выступами Т-клеточной мембраны и активирующей поверхностью и поддерживается продолжающимся образованием микрокластеров на периферии распространяющейся клетки ^6,7 . Поскольку ранние и поздно сформировавшиеся микрокластеры различаются как по географии, так и по функциям, мы стремились проанализировать кинетические задержки между молекулярным рекрутированием как в ранних, так и в поздних микрокластерах.Визуализация TIRF T-клетки Jurkat, экспрессирующей TCRζ-Emerald и ZAP70-Apple, была инициирована до того, как клетка вступила в контакт с покровным стеклом, покрытым анти-CD3ε, и отображалась в течение 4 минут для захвата полного временного спектра образования микрокластеров. Поразительно, что мы наблюдали незначительное или полное отсутствие кинетического запаздывания между TCRζ-ZAP70 в самых ранних сформированных микрокластерах (рис. 6a, слева, 50–100 с) с переходом к более длительным кинетическим задержкам по мере прогрессирования активации Т-клеток (рис. 6a, справа, сравните 75 с [рано] со 150 с [поздно]). Отметим, что кинетические запаздывания в поздно сформировавшихся микрокластерах установились в диапазоне от 20 до 40 с, в среднем около 27 с, что соответствует кинетическим запаздываниям TCRζ-ZAP70, измеренным ранее (сравните 100 и 200 с на рис.2f – 6a) и указывает на то, что измерения кинетического запаздывания на предыдущих рисунках отражают поздно сформированные микрокластеры. Такая же картина наблюдалась для кинетических лагов ZAP70-GRB2, при этом кинетическое отставание практически не наблюдалось между рекрутированием GRB2 в ZAP70 в ранее сформированных микрокластерах (рис. 6b, слева, 0–50 с), увеличивая кинетическое отставание с течением времени (рис. 6b, справа, сравните 34 с [начало] с 110 с [поздно]), и кинетические запаздывания в поздних микрокластерах, соответствующие кинетическим лагам ZAP70-GRB2, измеренным на предыдущих рисунках (сравните 50–150 с на рис.2f – 6b).

Кинетические запаздывания между рекрутированием компонентов микрокластера зависят от внутриклеточного потока кальция. a График кинетических лагов, измеренных между TCRζ-Emerald и ZAP70-Apple в микрокластерах, сформированных в указанное время получения изображения в одной и той же Т-клетке Jurkat, активированной при 21 ° C (слева). Типичные графики интенсивности TCRζ-Halo-JF646 (зеленый) и ZAP70-Emerald (красный), измеренные в микрокластере через 75 и 150 секунд после активации Т-клеток (справа). b График кинетических лагов, измеренных между ZAP70-Emerald и GRB2-Halo-JF646 в микрокластерах, сформированных в указанное время получения изображения в одной и той же Т-клетке Jurkat, активированной при 21 ° C (слева). Типичные графики интенсивности ZAP70-Emerald (красный) и GRB2-Halo-JF646 (зеленый) во время ранней (34 с, середина) и поздней (110 с, справа) временных фаз активации Т-клеток (справа). c Типичные графики интенсивности TCRζ-Emerald (зеленый) и ZAP70-Scarlet (красный) (верхний ряд) или ZAP70-Scarlet (красный) и GRB2-Emerald (зеленый) (нижний ряд) в микрокластере в ячейке Jurkat обработанные BAPTA и EGTA (левый столбец), или между TCRζ-Halo-JF646 (зеленый) и ZAP-Scarlet (красный) (верхний ряд), или ZAP70-Scarlet (красный) и GRB2-Halo-JF646 (зеленый) (внизу) row) в клетках, экспрессирующих GCaMP6, в буфере для визуализации с 2 мМ CaCl ₂ (средний столбец) или 5 мМ CaCl ₂ (правый столбец). d Средние кинетические запаздывания, измеренные между TCRζ и ZAP70 или ZAP70 и GRB2 в микрокластерах при указанных условиях хелатирования или повышения уровня кальция. * p <0,0001 по сравнению с ДМСО. n.s., незначительно по сравнению с ДМСО. Средние кинетические задержки, измеренные между e TCRζ-Emerald и GRB2-Scarlet или f ZAP70-Emerald и GRB2-Scarlet в микрокластерах при указанных внеклеточных концентрациях CaCl ₂

Любопытно, что мы заметили, что переход к более длинным кинетическим лагам совпало по времени с событием потока кальция, наблюдаемым на рис.5а. Поскольку кальций играет важную и разнообразную роль в качестве системы вторичного мессенджера в клетках, и поскольку внутриклеточные уровни кальция резко меняются из-за стимуляции TCR, мы стремились проверить, влияет ли внутриклеточный кальций на кинетику рекрутирования микрокластеров в активированных Т-клетках. Действительно, хелатирование кальция с использованием EGTA и BAPTA значительно уменьшило кинетические задержки между TCRζ-ZAP70 и ZAP70-GRB2 в поздно сформировавшихся микрокластерах (рис. 6c, d при 21 ° C и дополнительный рис. 4A при 37 ° C), указывая на то, что микрокластер Кинетика набора зависит от кальция.Сверхэкспрессия генетически кодируемого репортера кальция, GCaMP6, фенокопирует эффект EGTA / BAPTA на кинетические задержки (Fig. 6c, d), вероятно, из-за хелатирующего эффекта его кальций-связывающего кальмодулинового домена ⁴³ . Важно отметить, что увеличение внеклеточной концентрации кальция спасло фенотип. Когда клетки со сверхэкспрессией GCaMP6 были активированы в 5 мМ растворе CaCl ₂ вместо 2 мМ CaCl ₂ , кинетические задержки TCRζ-GRB2 и ZAP70-GRB2 в поздно сформированных микрокластерах не изменились по сравнению с клетками, обработанными DMSO ( Инжир.6в, г). Чтобы оценить эффекты увеличения кальция в кинетике микрокластеров, клетки обрабатывали ионофором кальция иономицином непосредственно перед тем, как поместить их на покровные стекла. В противоположность эффектам хелатирования кальция, повышение содержания кальция привело к значительному увеличению кинетических задержек (рис. 6d). Наконец, чтобы подтвердить корреляцию между кинетикой рекрутирования микрокластеров и концентрацией кальция, мы титровали концентрацию внеклеточного кальция в буфере для визуализации и измеряли задержки кинетики при каждой концентрации.Действительно, кинетические запаздывания в поздно сформировавшихся микрокластерах коррелировали с концентрацией внеклеточного кальция, поскольку кинетические запаздывания TCRζ-GRB2 и ZAP70-GRB2 были короткими при низких концентрациях (0–0,5 мМ CaCl ₂ ) и более длительными при физиологических концентрациях (1,0–2,0). мМ CaCl ₂ ), с переходом к более длинным кинетическим лагам между 0,5 и 1,0 мМ CaCl ₂ (рис. 6e, f). Взятые вместе, результаты на фиг. 6 показывают, что кинетические задержки между ступенчатым рекрутированием компонентов микрокластера зависят от кальция и регулируются внутриклеточным потоком кальция ниже по ходу активации TCR.

Куомо объявляет об обновленных фокусных зонах микрокластеров COVID-19

Губернатор Эндрю М. Куомо сегодня объявил обновленные фокусные зоны микрокластеров COVID-19 в штате Нью-Йорк. На основании показателей данных, включая результаты тестирования и частоту госпитализаций, красная зона Бруклина перейдет в оранжевую зону предупреждения. Губернатор также объявил о новых желтых предупредительных зонах в графствах Эри, Монро и Онондага.

«COVID растет по всей стране и по всему миру, и мы ожидаем, что эти показатели будут продолжать расти осенью и зимой», – сказал губернатор Куомо. «Долгосрочный прогноз заключается в том, чтобы получить вакцину как можно быстрее и вводить вакцину как можно быстрее, справедливо и беспристрастно. Тем временем мы справляемся с ростом, проводя больше тестов и целевых ограничений там, где это необходимо, и выполняя более строгие меры. я знаю, что люди устали – усталость от COVID реальна. Но вирус не устал. Красная, оранжевая и желтая зоны – это наш способ сказать, что вирус продвигается вперед, и мы собираемся усилить ограничения, и мы Увеличим исполнение.Когда мы видим небольшое увеличение, мы атакуем это небольшое увеличение – и цифры показывают, что это работает. Если мы будем оставаться умными и дисциплинированными, мы сможем справиться с этим – но для этого нам всем потребуется быть стойкими в Нью-Йорке ».

Изменения в текущих зонах фокусировки

Бруклин – Красная зона Изменения в оранжевой зоне предупреждения

Последнее На неделе Красная зона Бруклина была уменьшена в размере на 50 процентов в зависимости от прогресса. Показатели демонстрируют постоянный прогресс в контроле распространения COVID, и зона будет переведена в Orange, что позволит возобновить работу многих предприятий.

Новые зоны фокусировки

Округ Эри – Новая желтая предупредительная зона – Щелкните Здесь для просмотра карты

За последние десять дней в некоторых частях округа Эри средний уровень положительности за 7 дней превышал 2,5% , а количество случаев на 100 000 и новых ежедневных госпитализаций увеличилось, что соответствует показателям для обозначения желтой зоны.

Округ Монро – Новая желтая предупредительная зона – Нажмите Здесь , чтобы увидеть карту

За последние десять дней в некоторых частях округа Монро средний уровень положительных результатов за 7 дней превышал 3%, а число случаев на 100 000 и новых количество ежедневных госпитализаций увеличилось, что соответствует показателям, указанным в желтой зоне.

Округ Онондага – Новая желтая зона – Нажмите Здесь , чтобы увидеть карту

За последние десять дней в некоторых частях округа Онондага средний уровень положительных результатов за 7 дней превышал 3%, а число случаев на 100 000 и новых ежедневно Число госпитализаций увеличилось, что соответствует показателям, указанным в желтой зоне.

Губернатор напомнил, что ограничения желтой зоны для жителей Нью-Йорка включают в себя максимальную вместимость 25 человек на массовых собраниях, максимум 4 человека за столом во время обеда и 20% еженедельное тестирование студентов и преподавателей в школах.Бары и рестораны, расположенные в желтых предупредительных зонах, должны закрываться в полночь.

Показатель положительных результатов тестирования во всех сферах деятельности в рамках стратегии штата по микрокластерам составляет 4,32 процента, а за пределами зон фокусировки – 2,69 процента. В рамках приоритетных областей вчера было опубликовано 8 899 результатов тестов, из которых 384 оказались положительными. В остальной части штата, не считая этих областей внимания, было сообщено о 102517 результатах тестов, что дало 2760 положительных результатов. Полные результаты тестов, о которых сообщалось вчера, накануне, текущее скользящее среднее за 7 дней и последние две недели, приведены ниже:

Сродство, измеренное микрокластером

Резюме

Как и активация Т-клеток, активация В-клеток обусловлена ​​агрегацией Рецепторы В-клеток (BCR) в микрокластеры.Новая работа предполагает, что ранняя динамика подвижности BCR и образования микрокластеров «переводит» сродство BCR к антигену в чувствительность B-клеток.

В последние несколько лет был достигнут значительный прогресс в понимании запуска BCR и ранней передачи сигналов (Harwood and Batista, 2010). В этой области главным образом была работа лабораторий под руководством Факундо Батиста и Сьюзан Пирс. Батиста утверждал, что первичные В-клетки могут обычно распознавать лиганды, представленные другими клетками, через структуру, аналогичную иммунологическому синапсу Т-клеток (Grakoui et al., 1999; Батиста и др., 2001). Этот концептуальный прогресс и подтверждающие доказательства позволили им использовать визуализацию с высоким разрешением для визуализации молекулярной динамики и взаимодействий в поддерживаемых планарных двухслойных системах, которые позволяют вводить выбранные, латерально подвижные лиганды в контролируемых концентрациях (Fleire et al., 2006). Лаборатория Пирса использовала аналогичные модельные системы с трансформированными В-клетками для изучения структурных и сигнальных деталей, которые требуют обширной молекулярной инженерии самого BCR (Tolar et al., 2009b). В этом выпуске Liu et al. продолжить работу лаборатории Пирса, чтобы получить представление о том, как различия в сродстве BCR к антигену (Ag) считываются посредством образования субмикронных кластеров.

Связывание BCR с родственными антигенами гаптена инициирует последовательность событий, которая приводит к активации В-клеток (). То, как это происходит с моновалентными лигандами, свободно перемещающимися по поверхности, отличается от проблемы того, как агрегация BCR индуцируется поливалентными частицами; это различие нетривиально.МакКоннелл разработал поддерживаемую планарную двухслойную технологию, чтобы понять аналогичную проблему, заключающуюся в том, что моновалентные, латерально подвижные молекулы IgE, ограниченные поверхностью мембраны-мишени, могут способствовать агрегации микронного масштаба и передаче сигналов рецепторами Fc (Balakrishnan et al., 1982).

Моделирование шагов запуска BCR и ранней активации B-клеток на поддерживаемых планарных бислоев. Для изучения ранней передачи сигналов B-клеток, поддерживаемые плоские бислои (светло-пурпурный) загружены моновалентными антигенами (большие красные кружки) с молекулами адгезии, такими как ICAM-1, или без них, которые могут свободно диффундировать латерально вдоль двухслойной мембраны.Мембрана В-клеток (светло-голубая) показана со стороны цитоплазмы. В устойчивом состоянии (без Ag, стадия 0) комплексы BCR неактивны и могут мигрировать в плазматической мембране. После связывания Ag (этап 1) цепь Igμ претерпевает конформационное изменение (зеленый). Это приводит к кластеризации BCR (шаг 2), аресту комплекса и привлечению Lyn (желтый), возможно, через изменения в липидном микроокружении (полосатая область мембраны). Lyn фосфорилирует цепи Igα и Igβ (маленькие красные кружки), что приводит к разворачиванию цепей, в результате чего Syk (оранжевый) попадает в микрокластер (шаг 3).Микрокластер увеличивается в размере и стабильности за счет действия передачи сигналов Syk и взаимодействий с актиновым цитоскелетом.

Предыдущая работа предполагает, что криптические сайты связывания в BCR делают возможным ассоциацию с др. Латерально диффундирующими BCRs, чтобы управлять образованием микрокластеров (MC) (Tolar et al., 2009a). Перед воздействием антигена часть (∼20–60%) BCRs на поверхности B-клеток является латерально подвижной, но это зависит от изотипа (Treanor et al., 2010). IgM и IgG более подвижны, чем IgD.Эти различия, по-видимому, связаны с цитоплазматическим и трансмембранным доменами, поскольку замена этих участков IgM на соответствующие сегменты из белка MHC I увеличивает подвижность. Восстановление цитоплазматической области обратно до IgM снижает подвижность гибридного белка до уровней IgM дикого типа. Связывание Ag приводит к остановке мобильных BCR, но это остановка происходит не только за счет связывания одновалентного Ag. В присутствии низких концентраций одновалентного Ag только 12% BCR, связанных с Ag, фактически задерживаются (Tolar et al., 2009a), указывая тем самым, что кластеризация с др. BCRs (которые предположительно также связаны с Ag) необходимы для ареста.

Проксимальная к мембране область C4 цепи Igμ обеспечивает кластеризацию BCR, когда связывание Ag открывает скрытый сайт связывания (Tolar et al., 2009a). Удаление области C4 Igμ и вставка дополнительных трансмембранных мутаций (C4 + TM) устраняет кластеризацию и остановку BCR в ответ на вовлечение моновалентного Ag. Это не функция длины цепи Ig, поскольку другие усечения не влияют на кластеризацию или арест.Интересно, что фрагмент белка C4 + TM, экспрессируемый отдельно, может кластеризоваться независимо от Ag и рекрутировать нижестоящие сигнальные компоненты. Эти данные привели Толар и соавт. (2009b), чтобы предложить модель конформационных изменений запуска BCR. Следует отметить, что поливалентные Ag по своей природе могут агрегировать и запускать BCR даже в отсутствие домена C4.

Образование этих малых MC BCR важно для продуктивной передачи сигналов в B-клетках (и в T-клетках). В течение первых 30 секунд после запуска и кластеризации BCR src-киназа, Lyn, фосфорилирует иммунорецепторные тирозиновые мотивы активации (ITAM) Igα и Igβ, сигнальных цепей, связанных с Igμ.Технически строгие эксперименты с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), разработанные для измерения межбелковых расстояний, показали, что связывание Ag приводит к начальному всплеску FRET между Igµ и сигнальным комплексом Igα-Igβ, что согласуется с кластеризацией. Этот спайк FRET быстро затухает через 30 с, но только если происходит фосфорилирование ITAM. Мутации остатков тирозина ITAM или обработка ингибиторами Lyn, которые предотвращают фосфорилирование ITAM, также предотвращают снижение FRET. Поскольку комплекс не рассеивается во время фосфорилирования, считается, что падение FRET вызвано увеличением межбелковых расстояний, что вызвано «распаковкой» цепей Igα и Igβ.Это открытие отражает недавние открытия в Т-клетках относительно распаковки CD3ε в ответ на фосфорилирование после активации Т-клеток (Gil et al., 2002; Xu et al., 2008).

Lyn биохимически определяется как белок, связанный с липидным рафтом. Ассоциация BCR MC с Lyn происходит временно в течение первых 30 с после встречи с Ag. Рекрутирование src-kinase Lyn, как полагают, опосредуется изменениями в липидном микроокружении BCR, которые могут обогащать рафт-подобные белки (Sohn et al., 2008). Начальное образование MC не зависит от Syk, но рекрутирование Syk в MCs требует фосфорилирования ITAM, поскольку Syk стыкуется с ITAM через свой Sh3 домен (Bradshaw, 2010).Syk сигналы в периферических MC, пока они не достигнут центрального супрамолекулярного активационного кластера, где происходит дезактивация и деградация MC.

Неясно, какую роль сродство BCR к Ag играет в передаче сигналов ранних клеток BCR. Что касается конечного результата для клетки, из многочисленных исследований ясно, что В-клетки с BCR, имеющими более высокое сродство к Ag, превосходят клоны с более низким сродством BCR в ходе иммунного ответа (McHeyzer-Williams и McHeyzer-Williams, 2005). . BCR с более высоким сродством проявляет много преимуществ для В-клеток; большее поглощение Ag приводит к большему количеству Ag для представления и лучшей помощи Т-лимфоцитам.Чтобы определить, могут ли В-клетки различать антигены с высоким и низким сродством без вмешательства Т-лимфоцитов, Liu et al. (2010) протестировали влияние сродства BCR на раннюю передачу сигналов B-клеток. Используя BCR, обладающие высоким и низким сродством к 4-гидрокси-3-йод-5-нитрофенилу (Shih et al., 2002b), авторы смогли сравнить сильные и слабые стимулы. Используя инструменты, разработанные в их предыдущих исследованиях, они показали, что сродство BCR управляет мобильностью BCR, а также скоростью образования и роста MC. Эти данные показывают, что с самых ранних стадий сродство BCR усиливает функцию В-клеток.Кроме того, эти данные предоставляют механизм, объясняющий, как образование MC может определять качество Ag для B-клеток.

Вторым важным моментом этой статьи является разбивка образования MC на раннюю (зарождение) и позднюю (рост) стадии на основе высокоскоростной визуализации. Первая стадия (происходит в первые 30 секунд) не зависит от Syk, тогда как более поздняя стадия зависит от Syk. Сходным образом ингибиторы полимеризации микротрубочек блокируют поздние, но не ранние стадии роста ТЦ. Однако оказывается, что обе стадии развития MC зависят от динамики актина.Будет интересно посмотреть, какую роль на этих стадиях играют моторные белки цитоскелета.

Актин играет сложную роль в запуске BCR и формировании MC. В установившемся состоянии неподвижные BCRs, по-видимому, заключены в загоны в областях, обогащенных кортикальным актином и связями эзриновых мембран (Treanor et al., 2010). В предыдущих исследованиях Tolar et al. (2005) не наблюдали эффекта деполимеризации актина на FRET-профиль запуска BCR. Однако Liu et al. (2010) показали, что G-актин-секвестрирующий препарат латрункулин B, по-видимому, останавливает ранние и поздние стадии роста MC.Недавняя статья (Treanor et al., 2010) показала, что активация В-клеток может быть индуцирована даже в отсутствие Ag путем разрушения актинового цитоскелета с помощью деполимеризующих препаратов латрункулина A или цитохалазина D, или с помощью стабилизирующего актин препарата ясплакинолида; все препараты приводили к снижению содержания кортикального актина. Эти препараты были способны индуцировать приток кальция и фосфорилирование ERK способом, зависимым от Vav и фосфолипазы C-γ, предполагая, что эта передача сигналов может быть вызвана высвобождением иммобилизованных BCR.Актин играет критическую роль в стабильности и передаче сигналов от TCR MCs (Campi et al., 2005). Актиновый цитоскелет одновременно способствует одномолекулярной чувствительности TCR, одновременно сдерживая запуск BCR, так что для образования микрокластера необходимо много лигандов. Различная роль F-актина в T- и B-клетках согласуется с проблемами генерации комплексов MHC-пептид, что требует, чтобы B-клетка захватила ~ 500 белковых молекул для образования одного комплекса MHC-пептид (Dadaglio et al., 1997).

Другой важный аспект данных, представленных Liu et al. (2010) – открытие, что B-клетки, экспрессирующие BCR с низким сродством, все еще демонстрируют некоторый уровень запуска BCR и образования MC, хотя ответ более слабый и медленный, чем ответ от BCR с высоким сродством. Как и в предыдущих исследованиях, эти измерения были выполнены в системе одновалентного серебра. In vivo В-клетки, экспрессирующие такой же низкоаффинный BCR, описанный здесь, способны вызывать иммунный ответ, но только в отсутствие клонов с более высоким сродством и, возможно, только в ответ на поливалентные Ag (Shih et al., 2002а). Также может быть интересно посмотреть, как при низкоаффинных взаимодействиях кластеризация и арест BCR регулируют рекрутирование Lyn. Однако при слабых стимулах эти процессы могут быть чрезвычайно преходящими и их трудно измерить с помощью изображений. Наконец, эти данные важны для понимания того, как В-клетки определяют количественную аффинность, что может быть полезно для разработки более эффективных вакцин, направленных на слабые антигены.

Aquaspace Aquatomic Microclustering 3500 Устройство

Как система микрокластеризации Aquatomic 3500 улучшает качество воды?

Aquatomic 3500 использует сверхсильные редкоземельные магниты для микрокластеризации воды. Меньший кластер приводит к лучшему всасыванию воды через клеточные мембраны и стенки.

Микрокластеризация воды снижает поверхностное натяжение и делает воду более «биодоступной», тем самым улучшая перенос питательных веществ в клетки и удаление отходов из клеток.

Использование магнитов для улучшения качества и пользы воды для здоровья имеет долгую историю. Исследователи обнаружили, что когда постоянный магнит находится в контакте с водой, вода становится магнитно заряженной и приобретает магнитные свойства. Такая обработанная магнитами вода влияет на человеческий организм при регулярном приеме внутрь в течение значительного периода времени (Lam, 2001).

Многие такие устройства состоят из одного или нескольких постоянных магнитов, прикрепленных либо к внутренней, либо к внешней поверхности входящей водопроводной трубы. Вода подвергается воздействию магнитного поля, когда течет по трубе между магнитами. Вода и водные растворы, прошедшие через эти магнитные поля, приобретают более тонкую и однородную структуру (Ткаченко, Семёнова, 1995). Это увеличивает текучесть воды и помогает повысить способность воды растворять различные компоненты, такие как минералы и витамины (Kronenberg, 1985; Mikesell, 1985), и, следовательно, улучшает биологическую активность растворов, положительно влияя на производительность людей, животных и растений. (Линь, Йотват, 1989 и 1990; Ткаченко, Семёнова, 1995; Goldsworthy et al., 1999).

Структура воды и магниты

Жидкую воду следует рассматривать как большой кластер (например, гроздь винограда) молекул воды, в котором молекулы воды, связанные водородными связями (вода, связанная с водой), непрерывно формируются, распадаются на части. и реформирование. Эти электрически динамические молекулы воды легко разрываются и образуют связи с химическими соединениями, некоторые из которых необходимы для жизни, и, конечно же, некоторые менее чем полезны, например, хлор.

Молекулы воды полярны, то есть одна часть молекулы воды (водород) имеет положительный электрический заряд, а другая часть (кислород) – отрицательный; но в целом чистый электрический заряд нейтрален.Таким образом, молекула воды представляет собой небольшой магнит (диполь), на магнитное (или электрическое) поле которого можно влиять, заставляя молекулу поворачиваться или вращаться в одном или другом направлении, принимая положительный или отрицательный более высокий потенциал – в зависимости от того, было приложено южное (положительное) или северное (отрицательное) внешнее магнитное поле.

Магниты влияют на угол связи между водородом и атомом кислорода в молекуле воды. Намагниченная вода снижает угол связи водород-кислород в молекуле воды с 104 до 103 градусов.Это, в свою очередь, заставляет молекулу воды группироваться в группы из 6-7, а не в группы из 10-12 и выше. Меньший кластер приводит к лучшему всасыванию воды через клеточные мембраны и стенки.