Эпителиальные механизмы витамина D: (1) показано, что повышенная активность VDR подавляет NF-κB-зависимые эпителиальные пути апоптоза при экспериментальном колите.(2) Клаудин-2 (CL-2), параклеточный катионный канал, участвующий в формировании барьера, по-видимому, зависит от витамина D, хотя точный механизм требует дальнейшего раскрытия. Повышенная экспрессия CL-2 наблюдается в воспаленном кишечнике, который, в свою очередь, подавляется лечением 1,25 (OH) ₂ D. Низкий s-1,25 (OH) ₂ D у пациентов с ВЗК. связан со сниженной экспрессией zonula occludens 1 (белок плотных контактов) и E-cadherin (компонент соединения адгеринов).Более того, caco-2, линия клеток колоректального рака, активирует белки плотных контактов при стимуляции 1,25 (OH) ₂ D. (3) Обработка бактериального продукта бутиратом в линиях клеток толстой кишки человека значительно увеличивает экспрессию VDR. (4) Секреция связанного с катилицидином антимикробного пептида (цАМФ) и других АМП, таких как α-дефенсины из клеток Панета подвздошной кишки и β-дефенсины из колоноцитов, по-видимому, являются ключевыми факторами в регуляции микробиоты. Известно, что VDR увеличивает экспрессию АМФ, а также сводит на нет подавление экспрессии цАМФ, вызванное патогенами.Отсутствие VDR также влияет на функцию лизосом и аутофагию в эпителии кишечника, что означает роль VDR в регуляции микробов. (5) VDR играет роль в антигенпредставляющей функции дендритных клеток и, таким образом, в модуляции их иммунологического ответа. Активация VDR приводит к снижению соотношений IL-10 / IL-12, что способствует созреванию регуляторных Т-клеток и тем самым снижает провоспалительный ответ. ВЗК, воспалительное заболевание кишечника; ИЛ, интерлейкин.

Тем не менее, лишь в нескольких РКИ изучалось влияние добавок витамина D на исход ВЗК.В небольшом исследовании болезни Крона в стадии ремиссии 94 пациента были рандомизированы для приема 1200 МЕ витамина D3 в день или аналогичного плацебо. Исследование пришло к выводу, что прием добавок в течение 12 месяцев незначительно повысил уровни s-25 (OH) D и незначительно (p = 0,06) снизил долю пациентов с клиническим рецидивом с 29% до 13% .29

Однако добавление ко всем пациентам одинакового количества витамина D может привести к тому, что пациенты с низким базальным уровнем не достигнут терапевтического порога.Тем не менее, это не имело отношения к интервенционному исследованию с участием 18 пациентов с болезнью Крона30, которые применили дизайн, ориентированный на достижение уровня 25 (OH) D 100 нмоль / л вместо получения фиксированной суточной дозы витамина D. Через 6 месяцев, авторы сообщили о весьма значительном снижении показателей активности заболевания. К сожалению, это исследование имело определенные недостатки, в том числе очень небольшую когорту исследования и отсутствие контрольной группы30.

В рандомизированном контролируемом исследовании с участием 90 пациентов с нездоровым язвенным колитом31 сравнивались эффекты однократной внутримышечной инъекции очень высокой дозы витамина D (300 000 МЕ) с внутримышечной инъекцией 1 мл физиологического раствора (плацебо).Системное воспаление, измеряемое как уровень сывороточного СРБ, оценивалось через 3 месяца после вмешательства, показывая снижение в группе, получавшей витамин D3.31

Для решения некоторых проблем с недостаточной дозировкой витамина D в различных исследованиях в недавнем проспективном пилотном исследовании 10 пациентов с активной ВЗК и уровнем s-25 (OH) D <75 нмоль / л использовались пероральные дозы 5000. –10 000 Ед / сут. Корректировку дозы проводили 4 раза в неделю с целью достижения целевого уровня 100–126 нмоль / л. Пероральные дозы, использованные в протоколе, составляли 5000–10 000 Ед / день.За 12 недель исследования среднее увеличение составило 50 нмоль / л (20 нг / мл), при этом большинству пациентов потребовалось по крайней мере один 4-недельный период приема 10 000 ЕД / день. Целевой или почти целевой показатель был достигнут у всех участников в течение 12 недель, и, хотя сигнал о гиперкальциурии был отмечен у одного пациента, режим хорошо переносился, и показатели активности на основе симптомов улучшились.

В недавнем проспективном исследовании оценивали субъективные и объективные маркеры кишечного воспаления, а также фекальную микробиоту после замены витамина D у пациентов с активным и неактивным язвенным колитом и в контрольной группе без ВЗК.33 Дефицит витамина D определялся как 25 (OH) D <50 нмоль / л. Участвовали двадцать пять человек (восемь с активным заболеванием, девять с незаметным заболеванием, а также восемь контрольных лиц без ВЗК). Исследование впервые показало, что замена 40000 МЕ витамина D ₃ один раз в неделю в течение 8 недель у пациентов с активным язвенным колитом улучшила объективные маркеры воспаления, включая калпротектин, количество тромбоцитов, альбумин, а также показатели активности заболевания. Однако общее разнообразие микробиоты не изменилось, что позволяет предположить, что витамин D снижает воспаление кишечника независимо от бактериального состава фекалий.33

Несмотря на то, что доступные исследования имеют затруднения или ограничения (например, вариации в пороговых уровнях значений s-25 (OH) D, используемых для определения “ дефицита ”; различия в группах исследований и дизайнах, включая критерии включения и исключения, а также применяемые оценки активности; лечебные дозы; и исходы), и поскольку прямые сравнения между исследованиями осложняются отсутствием стандартизации между различными анализами, используемыми для измерения уровней 25 (OH) D 27, они, по-видимому, поддерживают концепцию витамина D, обладающего анти- воспалительные эффекты при ВЗК.12 14

Практический подход к добавлению витамина D для пациентов с ВЗК в клинических условиях

При выборе правильной стратегии приема добавок витамина D при ВЗК необходимо учитывать несколько факторов, включая активность заболевания, степень дефицита, мальабсорбцию, ожирение, комплаентность и солнце -выявительные привычки.

Уровни витамина D тесно связаны с активностью ВЗК. и их объединение, вероятно, представляет собой динамический процесс. Уровни витамина D непропорционально низкие среди пациентов с ВЗК с активным воспалением.34 Низкий уровень витамина D может увеличить риск будущего клинического рецидива ВЗК, 13 24 при лечении обострения ВЗК приводит к повышению уровня витамина D. Таким образом, важно сначала рассмотреть активность заболевания пациента с ВЗК, прежде чем составлять план для оптимизации уровня витамина D. Учитывая, что пациенты с ВЗК с обострениями заболевания имеют высокий риск развития мальабсорбции и дефицита витамина D, мы предлагаем вводить более высокую начальную болюсную дозу и тестировать мальабсорбцию среди пациентов с ВЗК с активным заболеванием (рисунок 2).

Подход к добавлению 25 (OH) D у пациентов с ВЗК. Определение адекватной суточной дозы как (целевой уровень s-25 (OH) D – текущий уровень s-25 (OH) D) мкг. Если целевой уровень не достигается в течение 3 месяцев, следует попробовать еженедельное болюсное введение. Если текущий уровень остается ниже целевого уровня, следует учитывать мальабсорбцию. CRP, C-реактивный белок; HBI, индекс Харви Брэдшоу; ВЗК, воспалительное заболевание кишечника; UCDAI, Индекс активности язвенного колита.

Несмотря на то, что не существует «золотого стандарта» для адекватных уровней s-25 (OH) D при ВЗК, большинство данных предполагают, что уровень s-25 (OH) D> 75 нмоль / л полезен по сравнению с пациентами с ВЗК с s-25. (OH) D <50 нмоль / л с точки зрения уровня маркеров воспаления и клинических оценок.16

Симптоматическая интоксикация витамином D (вызывающая гиперкальциемию и кальцификаты почек) встречается очень редко и в большинстве случаев сообщается только у людей с уровнем s-25 (OH) D выше 4–500 нмоль / л. Однако повышенный риск нежелательных явлений, по-видимому, связан с уровнями s-25 (OH) D> 200 нмоль / л.27 Соответственно, исходя из наших текущих знаний, представляется разумным стремиться к достижению s-25 ( Уровень OH) D находится в диапазоне 75–125 нмоль / л.

С фармакокинетической точки зрения было показано, что ежедневное и еженедельное пероральное дозирование, а также введение витамина D в виде большой пероральной или внутримышечной болюсной дозы (с интервалом в несколько месяцев) эффективны для поддержания уровня s-25 (OH) D на высоком уровне. уровень.Однако, хотя внутримышечные болюсные инъекции, как правило, достигают того же уровня, что и равная общая пероральная доза, повышение уровней s-25 (OH) D происходит с задержкой на месяц после инъекционной терапии35. или внутримышечная болюсная доза, как было показано в РКИ, увеличивает риск падений и переломов.36 37 Как следствие, Целевая группа профилактических служб США, а также другие недавно призвали с осторожностью использовать добавки с высокими дозами витамина D. 38 39 Поэтому ежедневная доза витамина D является предпочтительным вариантом.

Как показывает практика, уровни s-25 (OH) D увеличиваются примерно на 1 нмоль / л на 1 мкг (40 МЕ) ежедневного приема витамина D340. Эффект относительно более выражен при недостаточности витамина D по сравнению с у людей с избытком витамина D, тогда как реакция снижается с увеличением массы тела.41 Более того, сравнивая две наиболее распространенные формы витамина D, эрго- (D2) и холекальциферол (D3), холекальциферол кажется более сильнодействующим, чем эргокальциферол, при добавлении в больших количествах. оральный болюс.41 год

Соответственно, суточная доза витамина D (в мкг), необходимая для получения уровня s-25 (OH) D в целевом диапазоне (например, 100 нмоль / л), может быть оценена как 100 минус измеренное s-25 ( ОН) Уровень D. Уровни 25 (OH) D в сыворотке крови следует повторно измерить через 3-4 месяца. Если не в целевом диапазоне и нельзя исключить несоблюдение режима, можно рассмотреть возможность рекомендовать еженедельный прием добавок витамина D в дозе, равной расчетной суточной дозе. Если все еще не в целевом диапазоне, можно провести тест абсорбции витамина D, предоставив пациенту пероральную большую дозу (например, 100 000–300 000 МЕ) витамина D.В ответ на такую ​​высокую дозу следует ожидать значительного повышения уровня s-25 (OH) D в течение 2–4 недель42. Чтобы обеспечить соблюдение режима, болюсная доза должна вводиться под наблюдением медицинского работника. . Если ответ достигается после большого перорального болюса, наиболее вероятным объяснением отсутствия эффекта от ежедневного / еженедельного дозирования является низкая комплаентность или относительная мальабсорбция. Если это так, суточная / недельная доза витамина D может быть увеличена (удвоена / утроена), чтобы определить, может ли это привести к достижению уровня s-25 (OH) D в пределах целевого диапазона.Тем не менее, если в ответ на большой болюс не достигается значительного повышения уровня s-25 (OH) D, следует учитывать серьезную мальабсорбцию. Соответственно, могут потребоваться внутримышечные инъекции витамина D, но это следует рассматривать как последний вариант. В качестве альтернативы можно рассматривать частое пребывание на солнце или использование шезлонгов. Пациенты должны быть полностью проинформированы о том, что каждый эпизод пребывания на солнце (в постели) должен длиться только в течение такого короткого времени из-за потенциально повышенного риска злокачественных новообразований кожи.Следует учитывать время года, поскольку доза витамина D, необходимая для поддержания уровня витамина D, может быть ниже в летнее время. По той же причине мы рекомендуем измерять уровень 25 (OH) D не реже одного раза в год (предпочтительно в зимнее время) и чаще в случае недостаточности и / или во время обострения заболевания (каждые 3–4 месяца).

Наши предложения по оптимизации уровней 25 (OH) D с помощью добавок у пациентов с ВЗК, однако, следует интерпретировать с осторожностью из-за отсутствия долгосрочных РКИ по влиянию добавок витамина D при ВЗК.

Выводы и рекомендации

До сих пор неясно, является ли дефицит витамина D причиной ВЗК. Однако дефицит витамина D, по-видимому, преобладает при ВЗК и обратно связан с активностью заболевания, более частыми рецидивами, более частыми послеоперационными рецидивами, более низким качеством жизни и в целом аномальной реакцией на биологические препараты по сравнению с пациентами с нормальным или высоким s- Уровни 25 (OH) D.16 Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования для определения оптимального терапевтического уровня 25 (OH) D при ВЗК (т. Е. Следует ли рекомендовать другие пороговые значения для экстраскелетных преимуществ) или должны ли быть введены другие параклинические тесты, такие как витамин D-связывающий белок и свободный и биодоступный витамин D, а также прояснить, как витамин D изменяет уровни воспаления и его точное влияние на тяжесть заболевания.Следует дополнительно оценить, существуют ли различия в метаболизме и абсорбции витамина D при ВЗК. Кроме того, вмешательства должны быть сосредоточены на уровнях витамина D в бессимптомные периоды, когда это возможно, чтобы избежать путаницы и исследования его потенциального синергизма с текущими и будущими методами лечения ВЗК.

В совокупности имеющиеся данные подтверждают, что витамин D, по-видимому, играет непосредственную роль в патогенезе ВЗК как на клеточном, так и на фенотипическом уровне, и его потенциальную роль в качестве терапевтического агента в улучшении болезненного состояния у этих пациентов, даже при наличии имеющихся знаний основано на косвенных доказательствах.Таким образом, неясно, будет ли когда-либо однозначно установлена ​​причинно-следственная связь, поскольку промышленные спонсоры могут быть заинтересованы в финансировании РКИ надлежащего размера по добавлению витамина D в когорте вмешательства с незапатентованным препаратом.

Как уже упоминалось, кажется разумным предлагать пациентам с ВЗК измерения уровней s-25 (OH) D не реже одного раза в год (предпочтительно зимой). Мы предоставили читателю блок-схему приема добавок витамина D с относительно недорогими и доступными лекарствами и последующими наблюдениями.Такие усилия могут повысить вероятность достижения клинической ремиссии ИБК и применения традиционных терапевтических стратегий и, таким образом, привести к лучшим результатам для пациентов, а также к сокращению расходов на здравоохранение.

Инозин, полученный из кишечной микробиоты из пищевых добавок из листьев ячменя, ослабляет колит за счет активации передачи сигналов PPARγ | Microbiome

Приготовление порошка BL

Порошок BL, использованный в этом исследовании, был сырым порошком без какого-либо процесса экстракции и был предоставлен Hebei Biotechnology Co., Ltd. (Цзясин, Китай). Вкратце, свежие листья Hordeum vulgare L. (выращенного в Ханчжоу, Китай) промывали водой, разрезали на кусочки и сушили в сублимационной сушилке OE-950 (Labor, MIM, Будапешт, Венгрия) при -60 ° C. на 24 ч. Высушенный BL измельчали ​​в смесителе (KA-2610, Jworld Tech, Корея) в течение 1 мин, просеивали через сито 300 меш и хранили при -20 ° C до использования. Ближайший анализ порошка BL был выполнен Pony Testing International Group (Пекин, Китай) ( Дополнительный файл 2: Таблица S1 ) .

Эксперименты на животных

Восьминедельные самки мышей C57Bl / 6J были получены от Vital River Laboratory Animal Technology (Пекин, Китай) и содержались в среде, свободной от специфических патогенов (SPF) с 12-часовым циклом света и темноты. . Всех мышей адаптировали к лабораторным условиям с неограниченным доступом к пище и воде в течение как минимум одной недели. Эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по экспериментам на животных Центра науки о здоровье Пекинского университета (Пекин, Китай), и протоколы были одобрены Комитетом по этике животных этого учреждения.Мышей распределяли случайным образом и кормили либо стандартной пищевой диетой (CD), либо изокалорийной диетой, в которой BL добавлялся в соотношении 2,5%, дозировка, переведенная из предыдущего исследования с участием человека [24]. Состав двух диет был указан в Дополнительном файле 2: Таблица S2 и подготовлен Hfk Biotech Co, Ltd (Пекин, Китай).

Для лечения антагонистом PPARγ GW9662 или антагонистом A _2A R SCH58261 мышам вводили 3 мг / кг / день GW9662 внутрижелудочно [19] или вводили 2 мг / кг / день SCH58261 внутрибрюшинно [32].

Для эксперимента с антибиотиками использовали комбинацию неомицина (100 мг / л), стрептомицина (50 мг / л), пенициллина (100 мг / л), ванкомицина (50 мг / л) и метронидазола (100 мг / л). вводится с питьевой водой.

Для лечения инозином мышей внутрижелудочно вводили 800 мг / кг / день инозина (Sigma-Aldrich), растворенного в PBS, в концентрации 40 мг / мл [32].

Колит, вызванный декстран-сульфатом натрия (DSS)

Колит был вызван введением 2.5% DSS (молекулярная масса 36 000–50 000 кДа; MP Biomedicals) растворяли в питьевой воде в течение 7 дней. Мышей ежедневно взвешивали и наблюдали за признаками консистенции стула и ректального кровотечения. Оценка индекса активности заболевания проводилась путем объединения параметров потери веса, консистенции стула и ректального кровотечения, как описано ранее [60]. Индекс активности заболевания представлял собой среднее значение суммарной оценки трех параметров. Мышей умерщвляли на 7 день и измеряли длину толстой кишки.

Оценка кишечной проницаемости

Вкратце, флуоресцеинизотиоцианат (FITC) -декстран (4 кДа; Sigma) растворяли в PBS в концентрации 100 мг / мл. После того, как мышей голодали в течение 4 часов и перорально вводили FITC-декстран (60 мг / 100 г массы тела). Кровь собирали еще через 4 часа и центрифугировали при 1000 об / мин в течение 20 минут. Сыворотку собирали и флуоресценцию определяли количественно при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны испускания 535 нм.

Секвенирование и анализ гена 16S рРНК

Тотальную ДНК экстрагировали из содержимого толстой кишки или образцов фекальной культуры с использованием мини-набора QIAamp-DNA Stool Mini (Qiagen, Hilden, Германия).Целостность экстрагированной ДНК проверяли электрофорезом в 1% (мас. / Об.) Агарозных гелях. На основании количества и качества экстрагированной ДНК были отобраны образцы для последующего секвенирования.

ДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации области V3 – V4 бактериальных генов 16S рРНК. ПЦР-амплификацию выполняли на системе ABI GeneAmp®9700 PCR (AppliedBiosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США), а продукты амплификации ПЦР количественно оценивали с помощью портативного флуориметра QuantiFluor ^TM -ST с УФ / синими каналами (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин). , СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ).

Секвенирование продуктов ПЦР-амплификации выполняли на платформе Illumina Miseq в Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Вкратце, данные секвенирования гена 16S рРНК были отфильтрованы, обрезаны и далее классифицированы в операционные таксономические единицы (OTU) с разницей в 0,03 (эквивалент 97% сходства). Затем был создан репрезентативный набор последовательностей, которым была присвоена таксономия с использованием базы данных SILVA (Release115 http://www.arb-silva.de). Анализ кривых разрежения и расчет оценок богатства и индексов разнообразия проводился с помощью программы MOTHUR.Таксономическая структура сообщества и филогения были проанализированы посредством визуализации наборов данных о микробном разнообразии и численности различных образцов.

Анализ воспалительных цитокинов

Уровни цитокинов в сыворотке и тканях толстой кишки определяли с помощью набора для иммуноферментного анализа (ELISA) (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute Co., Ltd. Nanjing, Китай) в соответствии с инструкциями производителя.

Гистологическая оценка

Собранные образцы толстой кишки фиксировали в 4% параформальдегиде и заливали парафином.Залитые парафином ткани толстой кишки были разрезаны (толщиной 4 мкм) и подвергнуты окрашиванию гематоксилином и эозином (HE) и альциановым синим (AB) с использованием коммерческих наборов (Beijing Solarbio Technology Co., Ltd. Пекин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. инструкции. Высоту крипты и ширину мышечного слоя в толстой кишке измеряли с помощью ImageJ (Media Cybernetics, Inc., Роквилл, Мэриленд, США). Бокаловидные клетки, продуцирующие слизь, наблюдали и подсчитывали под световым микроскопом (Leica DM500).Случайным образом были выбраны шесть микроскопических полей каждого участка яичек.

Гистологическая патология оценивалась в соответствии с ранее установленной системой баллов, а именно: повреждение крипты (шкала 0–4), тяжесть воспаления (шкала 0–3) и глубина повреждения (шкала 0–3) [61].

Оценка перистальтики кишечника

Периодичность кишечника определяли путем оценки времени прохождения кишечника и частоты дефекации. После того, как мышей не голодали в течение 4 часов, отдельной мыши вводили через зонд 10 мкл / г 6% раствора кармина (в концентрации 0.5% метилцеллюлоза). Время от желудочного зондирования до начального появления кармина в фекалиях регистрировали как время прохождения через кишечник для данной мыши.

Частоту дефекации регистрировали путем разделения мышей в стерильную клетку, и кумулятивные фекальные гранулы в течение 60 минут регистрировали как соответствующее количество дефекаций для данной мыши.

Сканирующая электронная микроскопия

Ткани толстой кишки фиксировали 2,5% -ным разведением PBS глутаральдегидом. После трехкратной промывки в PBS образцы фиксировали в 1% тетроксиде осмия в течение 1 часа, обезвоживали в спирте и затем сушили до критической точки с использованием CO ₂ .Образцы были покрыты золотом и исследованы в сканирующем электронном микроскопе Hitachi S-3400 (Hitachi, Япония).

Просвечивающая электронная микроскопия

Ткани толстой кишки фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом. PBS использовали для удаления излишков фиксатора. Затем образцы фиксировали 1% тетроксидом осмия при 4 ° C в течение 2 ч, обезвоживали в ацетоне. Наконец, образцы были пропитаны пропиленоксидом 1: 1 и смолой EPON в течение 1 часа с последующей инфильтрацией в течение ночи в 100% смоле EPON. Ткани помещали в плоские формы в 100% EPON на 36 часов при 60 ° C.Ультратонкие срезы размером 70 нм окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца (по 10 мин каждый) и просматривали под просвечивающим электронным микроскопом H-7650 (Hitachi, Япония).

Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция

После депарафинизации и регидратации срезы толстой кишки блокировали 5% бычьим сывороточным альбумином в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем промывали PBS. Срезы тканей инкубировали с первичным антителом Muc-2 (Santa Cruz, sc-515032), Ly6G (Abcam, ab25377) и F4 / 80 (Abcam, ab6640) в течение ночи при 4 ° C.Предметные стекла трижды промывали PBS перед нанесением вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой (Invitrogen), на 2 часа при комнатной температуре.

Для иммунофлуоресцентного окрашивания залитые парафином срезы или клетки толстой кишки инкубировали с первичным антителом PPARγ (Abcam, ab59256) при 4 ° C в течение ночи. На следующий день использовали вторичное антитело осла против кролика Alexa Fluor488 (Invitrogen).

Количественная ПЦР в реальном времени

Суммарную РНК тканей толстой кишки выделяли с использованием реагента ТРИЗОЛ (Invitrogen, США).Количество и чистоту РНК оценивали по поглощению при 260 нм и 280 нм. Обратную транскрипцию 10 мкл РНК проводили с использованием PrimeScript RT Master Kit (Takara, Japan). Экспрессию генов измеряли в одноцветной системе обнаружения ПЦР в реальном времени MyiQ (Bio-Rad) с набором SYBR Real-time PCR Kit (Takara, Япония). GAPDH использовали в качестве эндогенного контроля. Средние значения Ct из трех анализов нормализовали по средним значениям Ct GAPDH. Последовательности праймеров описаны и синтезированы Sunbiotech Co.(Пекин, Китай) ( Дополнительный файл 2: Таблица S3 ) .

Секвенирование РНК.

Ткани толстой кишки собирали и общую РНК экстрагировали с использованием реагента ТРИЗОЛ (Invitrogen, США). Качество РНК оценивали электрофорезом с использованием биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies, Сан-Диего, Калифорния, США). Образцы с числами целостности РНК (RIN)> 9,4 и с коэффициентами поглощения 260/280 нм от 1,9 до 2,1 использовали для создания библиотек RNA-Seq.Библиотеки были сконструированы с использованием набора TruSeq ™ RNA Sample Prep (Illumina, San Diego, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя.

Секвенирование библиотек выполняли на приборе Illumina HiSeq2000 от Shanghai Majorbio Biopharm Biotechnology (Шанхай, Китай) и индивидуально оценивали качество с помощью FastQC. Анализ дифференциальной экспрессии проводился с помощью DESeq2 [62]. Статистическая значимость оценивалась с использованием отрицательного биномиального критерия Вальда, затем корректировалась для проверки множественных гипотез с помощью метода Бенджамини-Хохберга.Кластерный анализ функционального обогащения был выполнен для анализа пути обогащения Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG).

Ненаправленная метаболомика

Метаболомика на основе газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) была выполнена компанией ProfLeader Biotech (Шанхай, Китай). Вкратце, образцы сыворотки отделяли от крови центрифугированием и хранили при -80 ° C. Содержимое толстой кишки или образцы ткани толстой кишки, смешанные с водой, встряхивали перед центрифугированием. Супернатант переносили во флакон для ГХ, содержащий внутренние стандарты.Смесь сушили в слабом потоке азота и затем добавляли гидрохлорид метоксиамина в пиридине. Полученную смесь интенсивно встряхивали и инкубировали при 37 ° C в течение 90 мин. Дериватизацию проводили путем добавления в смесь BSTFA (с 1% TMCS). Дериватизированные образцы анализировали с помощью системы газовой хроматографии Agilent 7890A, соединенной с инертной системой MSD Agilent 5975C (Agilent Technologies, Калифорния, США). Для разделения производных использовали капиллярную колонку с плавленым кремнеземом HP-5MS.Гелий использовался в качестве газа-носителя при постоянной скорости потока через колонку. Образцы анализировали в случайной последовательности.

Полученные данные ГХ / МС были импортированы в SIMCA Statistical Analysis (версия 13.0, Umetrics AB, Умео, Швеция), где проводился многомерный статистический анализ, включая анализ главных компонентов (PCA) и частичный дискриминантный анализ методом наименьших квадратов (PLS-DA). выполнила. Дифференциальные метаболиты определялись сочетанием важности переменной в прогнозном значении (VIP) (> 1) модели PLS-DA и значений P (<0.05) из двустороннего теста Стьюдента t на нормированные интенсивности пиков. Изменение кратности рассчитывали как двоичный логарифм среднего нормализованного отношения площадей пиков между двумя группами. Структурную идентификацию дифференциальных метаболитов проводили с использованием программного обеспечения AMDIS, где очищенные масс-спектры автоматически сопоставлялись с внутренней стандартной библиотекой, включая время удерживания и масс-спектры, библиотеку Agilent Fiehn GC / MS Metabolomics RTL и базу данных Golm Metabolome соответственно.

Количественный анализ метаболитов пурина

Образцы сыворотки, содержимого толстой кишки или фекальных культур смешивали с дистиллированной водой, содержащей внутренний стандарт (4-аминосалициловую кислоту). Смесь экстрагировали этилацетатом. После центрифугирования верхний слой переносили и упаривали досуха в токе азота. Сухой остаток восстанавливали в ацетонитриле и BSTFA (с 1% TMCS) и дериватизировали для проведения анализа GC-MS. Для количественного определения готовили смешанный стандартный раствор, содержащий исходные стандартные растворы инозина и гуанозина в концентрации 100 мкг / мл.

Анаэробное культивирование in vitro

Свежие фекалии мышей (0,5 г) 8-недельных мышей-самцов C57Bl / 6 ресуспендировали в 10 мл стерильного PBS и совместно культивировали с порошком BL с конечной концентрацией 10 мг / мл ниже анаэробные условия (10% H ₂ , 10% CO ₂ , 80% N ₂ ). После инкубации в течение 12 и 24 часов культивированные образцы собирали и использовали для обнаружения метаболитов и анализа бактериального состава.

Культура клеток и обработка

Клеточные линии эпителиальной карциномы толстой кишки человека HT29 и Caco2 были приобретены из Американской коллекции типовых культур (АТСС).Клетки поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина в увлажненном инкубаторе (5% CO ₂ , 95% воздуха, 37 ° C). Клетки выращивали до 80-90% слияния и обрабатывали в течение указанных периодов времени инозином (Sigma-Aldrich) и гуанозином (Sigma-Aldrich) из исходного раствора в PBS до конечной концентрации 0,5, 1, 2 и 4 мМ. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью набора для анализа жизнеспособности клеток Cell Counting Kit (CCK) -8 от GenMed Inc.(Шанхай, Китай) согласно инструкции производителя.

Анализ репортерной люциферазы

Плазмидный вектор PPARγ-люциферазы был приобретен у RiboBio Co., Ltd (Гуанчжоу, Китай). Клетки HT29 временно трансфицировали с использованием реагента липофектамин 3000 (ThermoFisher Scientific). Вкратце, 1 × 10 ⁵ клеток высевали на 6-луночные планшеты и выращивали в течение 24 часов. Комплекс для трансфекции, содержащий 1 мкг плазмидной ДНК и реагент для трансфекции, добавляли в каждую лунку в отсутствие FBS.Через 6 часов добавляли среду, содержащую 10% FBS, и клетки обрабатывали инозином и гуанозином (0,5, 1, 2 и 4 мМ) в течение 24 часов. Активность люциферазы измеряли с помощью системы анализа люциферазы (Promega) с использованием люминометра (Perkin Elmer, Covina, CA).

Вестерн-блот-анализ

Клетки лизировали лизисным буфером с 1% смесью ингибиторов протеазы для сбора общего клеточного белка. Концентрацию экстрагированного белка определяли количественно с помощью набора для анализа белков бицинхониновой кислоты (BCA) (Beyotime).Равное количество образца белка наносили на гель для электрофореза додецилсульфат-полиакриламидного геля и затем переносили на поливинилидендифторидную мембрану (Millipore, Billerica, MA, USA). После блокирования мембраны обезжиренным молоком ее инкубировали с первичными антителами против Muc2 (Santa Cruz, sc-515032), PPARγ (Abcam, ab59256), A _2A R (Abcam, ab3461) и GAPDH (Abcam, ab8245 ). На следующий день в течение 2–3 часов зондировали вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена.Сигналы белков детектировали с помощью реагента с усиленной хемилюминесценцией ECL в соответствии с инструкциями производителя.

Малая интерферирующая РНК

siRNA против PPARγ или A _2A R была приобретена у GenePharma (Шанхай, Китай). Для экспериментов по нокдауну 1 × 10 ⁵ клеток HT29 и Caco2 помещали в 6-луночные планшеты и выращивали в течение 24 часов. PPARγ, A _2A R или контрольную миРНК трансфицировали в клетки с использованием реагента липофектамин 3000 (ThermoFisher Scientific).Через 24 часа трансфекций клетки индуцировали инозином (0, 2 и 4 мМ) в течение 24 часов. Затем клетки лизировали с использованием буфера RIPA, и экспрессию белка A _2A R, PPARγ или Muc2 определяли с помощью вестерн-блоттинга.

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием Prism 6.0 (GraphPad Software, CA). Данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего. Значительные различия между двумя группами оценивали с помощью двустороннего непарного теста Стьюдента t .Значимые различия в более чем двух группах оценивали с помощью однофакторного или двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественных сравнений Тьюки.

При анализе данных секвенирования кишечной микробиоты был проведен двусторонний тест суммы рангов Вилкоксона от R Project. При анализе различий в распределении обилия среди метаболитов был проведен тест Манна-Уитни U с коррекцией ложной скорости обнаружения по Бенджамини-Хохбергу. Различия считались достоверными при P <0.05.

Прекращение взаимодействия интегрина EMILIN1-β1 способствует экспериментальному колиту и канцерогенезу толстой кишки

Основные моменты

•

EMILIN-1 / β ₁ Взаимодействие интегринов оказывает онкосупрессивную роль в микросреде толстой кишки 8

•

Потеря экспрессии EMILIN-1 влияет на разрешение воспаления в CAC

•

Недостаток EMILIN-1 вызывает формирование аберрантного лимфангиогенеза, приводящего к нефункциональным лимфатическим сосудам

Abstract

Рак толстой кишки является одним из первые типы опухолей, в которых описана функциональная связь между воспалением и возникновением опухоли; однако сигналы микросреды, влияющие на прогрессирование рака толстой кишки, плохо изучены.Здесь мы демонстрируем, что экспрессия молекулы ЕСМ EMILIN-1 останавливает развитие опухолей, индуцированных AOM-DSS. Фактически, после обработки AOM-DSS мыши Emilin1 ^{– / –} ( E1 ^{– / –} ) характеризовались более высокой заболеваемостью опухолями, более крупными аденомами и меньшей выживаемостью. Аналогичные результаты были получены с моделью трансгенной мыши E933A EMILIN-1 (E1-E933A), экспрессирующей мутантный EMILIN-1, неспособный взаимодействовать с интегринами α4 / α9β1.Интересно, что при хроническом лечении DSS мыши E1 ^{– / –} и E1-E933A характеризовались наличием повышенных воспалительных инфильтратов, более высокими показателями колита и более серьезными повреждениями слизистой оболочки по сравнению с диким типом ( E1 ^{+ / +} ) мышей. Поскольку изменения лимфатической сети кишечника являются хорошо изученным признаком воспалительного заболевания кишечника человека, а ЭМИЛИН-1 является ключевым структурным элементом в поддержании целостности лимфатических сосудов, мы оценили лимфатическую сосудистую сеть в этом контексте.Анализ показал, что мыши E1 ^{– / –} и E1-E933A показали более высокую плотность LYVE-1-положительных сосудов; однако их функциональность была серьезно нарушена после индукции колита. Взятые вместе, эти результаты предполагают, что потеря экспрессии EMILIN-1 может вызвать снижение воспалительного процесса во время прогрессирования рака толстой кишки из-за уменьшения лимфотока и нарушения оттока воспалительных клеток.

Аббревиатуры

декстрансульфат натрия

рак, ассоциированный с колитом

лимфатические эндотелиальные клетки

Ключевые слова

Статьи внеклеточного матрикса

Рак, ассоциированный с колитом

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Лизаты Methylococcus capsulatus Bath индуцируют постную микробиоту, кишечные Treg-клетки FoxP3 + RORγt + IL-17 + и улучшают метаболизм

ut Abstract

Взаимодействия между микробами и организмом-хозяином сообщества могут регулироваться диетой и играть ключевую роль в обеспечении иммунологического гомеостаза и здоровья. Здесь мы показываем, что потребление корма на основе лизатов целых клеток некомменсальной бактерии Methylococcus capsulatus Bath (McB) в качестве источника белка обращало вызванные высоким содержанием жира и высоким содержанием сахарозы изменения в микробиоте кишечника до состояния, напоминающего состояние постного мяса. мышей, получавших пищу с низким содержанием жира, как при умеренном тепловом стрессе (T _{22 ° C} ), так и при термонейтральности (T _{30 ° C} ).Кормление McB избирательно активировало тройные положительные (Foxp3 ⁺ RORγt ⁺ IL-17 ⁺ ) регуляторные Т-клетки в тонком кишечнике и толстой кишке и увеличивало продукцию слизи и статус гликозилирования, что свидетельствует об улучшении здоровья кишечника. Мыши, получавшие лизаты McB, дополнительно продемонстрировали улучшенную регуляцию глюкозы, снижение содержания жира в организме и печени, а также снижение иммунной инфильтрации в печени. В совокупности эти данные указывают на глубокое воздействие лизата McB на все тело, предполагая, что он может служить мощным модулятором иммунометаболического гомеостаза.

Введение

Кишечные микробы формируют кишечный иммунитет ¹ и увеличивают биодоступность других неперевариваемых питательных веществ ² . Следовательно, хорошо сбалансированная структура сообщества важна для иммунометаболического гомеостаза, тогда как аберрантные составы кишечной микробиоты связаны с многочисленными заболеваниями как внутри, так и за пределами желудочно-кишечного тракта ³ .

В то время как терапевтические последствия восстановления баланса неправильно настроенной микробиоты кишечника кажутся многообещающими, непоследовательная частота ответа в отношении как пробиотиков, так и исследований фекального переноса со случайными побочными эффектами подчеркивает сложность таких подходов.Один пример относится к многообещающему пробиотическому кандидату Akkermansia muciniphila ⁴ , где отрицательные эффекты наблюдались у реципиентов с ослабленным иммунитетом ^{5, 6} . Аналогичным образом, Prevotella copri способствует метаболизму волокон у здоровых людей ⁷ и защищает от бактериальной инвазии у мышей с высоким содержанием клетчатки, получавших пищу ⁸ , но при этом ассоциируется с инсулинорезистентностью у лиц с преддиабетическим ожирением и вызывает нарушения глюкорегуляции у индуцированных диетой ожирение (DIO) мышей ⁹ .

Альтернативой введению жизнеспособных микробов является использование лизатов целых клеток или отдельных клеточных компонентов неживых бактерий. Помимо снижения глобального спроса на энергию, при использовании в качестве источника питательных веществ, такие компоненты могут также сильно влиять на физиологию хозяина, как недавно сообщалось для A. muciniphila ¹⁰ и Bifidobacterium bifidum ¹¹ . В последнем примере полисахариды клеточной поверхности B. bifidum использовали для индукции периферической иммунной толерантности посредством образования регуляторных Т-клеток (T _regs ).Авторы сообщили о выраженном увеличении Foxp3 ⁺ RORγt ⁺ T _regs ( _p T _regs ), особенно в собственной пластинке толстой кишки (LI) ¹¹ . Считается, что этот тип клеток индуцируется комменсальными микробами и возник как мощная подгруппа T _reg , демонстрирующая повышенную стабильность клонов и повышенную иммуносупрессивную способность во время воспаления кишечника по сравнению с обычным Foxp3 ⁺ RORγt ^– T _regs ( _n T _{регистр} ) ¹² .

RORγt – канонический фактор транскрипции, контролирующий экспрессию IL-17; плейотропный цитокин как с провоспалительным, так и с иммуноразлагающим действием в зависимости от типа вызывающих клеток и физиологического контекста ¹³ . К сожалению, исследования, описывающие функцию _p T _reg , не измеряли секрецию IL-17. Таким образом, остается неизвестным, демонстрируют ли эти клетки нормальные, пониженные или повышенные уровни IL-17, и как это отражается на физиологии хозяина.Влияние этого преимущественно подмножества клеток толстой кишки на метаболизм хозяина также остается неизвестным. Тем не менее, все больше данных указывает на важность кишечного IL-17 для контроля метаболического гомеостаза ^{14, 15} . IL-17 ⁺ _p T _regs , следовательно, может использоваться как стратегия «двойного удара» для сдерживания иммунометаболической дисфункции и желудочно-кишечных расстройств на основе иммунорегуляторной способности _p T _regs , сопутствующей метаболической преимущества кишечного доставки IL-17.

С этой целью мы выдвинули гипотезу, что бактерии окружающей среды, которые не подвергались эволюционному изучению на предмет взаимодействия хозяина и микроба, будут обеспечивать неизученный резервуар иммуномодулирующих стимулов. В поддержку этой гипотезы ранее было показано, что метанотропная некомменсальная бактерия Methylococcus capsulatus Bath (McB) снижает воспаление и активность заболевания при колите, вызванном декстрансульфатом натрия (DSS) ²⁴ . Однако влияние на метаболизм хозяина и иммунные клетки кишечника, а также на динамику слизи не изучалось.

Соответственно, мы исследовали эффект использования лизатов цельных клеток из McB в качестве источника белка для изменения иммунометаболизма и аберрантной микробиоты кишечника мышей DIO. Мы показываем, что лизаты McB увеличивают Foxp3 ⁺ RORγt ⁺ IL-17 ⁺ тройной положительный _p T _regs как в SI-, так и в LI-LP, и сбрасывают микробиоту ожирения, сопутствующую обратным ключевым признакам заболевания ожирение, вызванное диетой.

Материалы и методы

Мыши и этические заявления

Все эксперименты проводились в соответствии с директивой ЕС 2010/63 / EU, одобренной Датской инспекцией экспериментов на животных (№ 2014-15-2934-01,027).6-7-недельных самцов мышей C57BL / 6JBomTac и C57BL / 6JRj были приобретены из Taconic Laboratories, Дания или Janvier Labs, Франция, соответственно, как подробно описано ниже. Всем мышам позволяли акклиматизироваться к обычному питанию в течение первой недели по прибытии, а затем кормили LFD в течение двух недель до начала исследования. Мышей содержали в определенных условиях, свободных от патогенов, при температуре 22 ° C (T _{22 ° C} ) или 30 ° C (T _{30 ° C} ), как указано, в 12-часовом цикле свет / темнота (6:00 – 18:00).

Размещение, диеты и экспериментальная установка

Стандартные гранулированные диеты, а также порошок западной диеты без белков (WD) были получены от Ssniff Spezialdiäten GmBH, Германия, и хранились при -20 ° C на протяжении всего эксперимента.Мышей кормили диетой с низким содержанием жиров (LFD, S8672-E050) определенного состава до начала исследования. Подгруппа осталась на LFD, тогда как оставшиеся мыши были переведены на контрольный WD на основе соевого масла (S8672-E025) (с высоким содержанием жира, высоким содержанием сахарозы, содержащим 0,15% холестерина) на вводный период (12 или 21 неделя в зависимости от эксперимент). Экспериментальные WD были сопоставлены по партиям и получены без белка (S9552-E021), который впоследствии был добавлен и затем осажден исследователями, как указано; WD _REF = содержит 19.5% (вес / вес) казеина, WD _CNTL = содержащий 16,5% (вес / вес) казеина и 3% масла макадамии, WD _McB = 19,5% (вес / вес) лизатов цельноклеточных бактерий (преимущественно белков, но до ∼15% фосфолипидов ¹⁶ ). Состав рациона более подробно описан в Таблице S1. Подробное описание бактериальных лизатов приведено в соответствующем разделе ниже. Все диеты были свежеприготовленными для каждого эксперимента с независимыми партиями бактериальных лизатов, чтобы подтвердить надежность и воспроизводимость наблюдаемых результатов.Мышей кормили ad libitum , и потребление корма измеряли трижды в неделю. Воду меняли еженедельно.

12 + 6 протокол T

Экспериментальная установка показана на рисунке 1A. Мыши C57BL / 6JRj были приобретены в Janvier Labs, Франция, и содержали по 3 мыши на клетку, воспроизведенных в двух независимых экспериментах. Для прозрачности все данные изображены на соответствующих графиках со средним значением ± стандартная ошибка среднего плюс отдельные точки для объединенных результатов двух независимых экспериментов.Формы, зависящие от эксперимента, позволяют визуально различать соответствующие эксперименты, а также распределять данные внутри и между экспериментами.

A) Схема исследования двух независимых экспериментов с начальной западной диетой (WD _REF ) кормление в течение 12 недель при 22 ° C и пероральное тест толерантности к глюкозе (OGTT), глюкозо-стимулированная секреция инсулина (GSIS) и состав тела с помощью МРТ-сканирования, оцененных через 11 недель для стратификации групп (☐), с последующим диетическим вмешательством в течение 6 недель кормления WD, включая лизат McB (WD _McB ) или подобранную контрольную диету WD (WD _CNTL ).В течение экспериментального периода через указанные интервалы проводились исследования состава тела, OGTT, GSIS и отбор свежих фекалий. Тест на толерантность к инсулину (ITT) проводили в первом из двух экспериментов в указанный момент времени. Второй эксперимент включал контрольную группу мышей, получавших питание с низким содержанием жиров (LFD). Группы или процедуры, однозначно представленные в одном эксперименте, выделены курсивом. B) Анализ основных координат (PCoA) с использованием взвешенных расстояний UniFrac для фекальной микробиоты, отобранных в первом и втором эксперименте раз в две недели в течение периода диетического вмешательства, как показано числами после диетического вмешательства в центроидах.Группы WD _CNTL и WD _McB были схожи по составу микробиоты до диетического вмешательства на неделе 12 + 0 (PERMANOVA p = 0,88 и 0,43 в Exp1 и Exp2, соответственно). В конце каждого эксперимента состав микробиоты значительно отличался между этими группами (PERMANOVA p = 0,001 и 0,002 в Exp1 и Exp2, соответственно). C) Taxasсводка наиболее распространенных бактериальных родов, показывающая среднюю относительную численность в% указанного семейства и родов в каждой группе в указанные моменты времени D) Deseq анализ численности родов фекальных бактерий, значительно регулируемых вмешательством McB по сравнению с WD _CNTL (стр.прил. <0,05). Относительная численность в% в каждой группе и вариация показаны для каждого регулируемого рода в выбранные временные точки. Изменения кратности и скорректированные значения p для индивидуума указаны в таблице S3. E) Соотношение Firmicutes / Bacteroidetes в образцах фекалий отдельных мышей до (12 + 0) и после 6 недель диетического вмешательства (12 + 6) в Exp1 (◆) и Exp2 (●). n = от 6 (LFD) до 15 (WD _McB и WD _CNTL ). Статистическая значимость обозначена * в парном t-тесте. F) Взвешенное расстояние UniFrac (тест нестабильности) между парными образцами из указанного двухнедельного интервала после диетического вмешательства в Exp1 (◆) и Exp2 (●). n = от 6 (LFD) до 15 (WD _McB и WD _CNTL ). Статистическая значимость обозначена * в парном t-тесте. GH) Основные короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA) (ацетат, пропионат и бутират) и второстепенные SCFA (изобутират, изовалерат и валерат) в содержимом слепой кишки как кратное изменение пмоль на слепую кишку в Exp1 (◆) и Exp2 (● ).n = 6 (LFD) и 10-11 (WD _CNTL и WD _McB соответственно). Статистическая значимость по сравнению с WD _CNTL с помощью однофакторного дисперсионного анализа с множественным сравнением и апостериорного анализа Даннета обозначена *. E-H) * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

21 + 5 протокол T

Экспериментальная установка показана на рисунке 4A. Мышей C57BL / 6JBomTac покупали в Taconic Laboratories, Дания, и первоначально содержали по 10 мышей на клетку для ускорения набора веса.Через 12 недель вводного периода мышей помещали в одиночную клетку, чтобы дать возможность точной оценки потребления пищи, а также контролировать, будет ли более чувствительный микробиом мышей в одиночном корпусе равномерно изменяться в сторону состава, типичного для мышей, получавших LFD, или если таковой Этот феномен основывался на том, что несколько мышей с высокой ответной реакцией переносили свой микробиом товарищам по клетке в условиях группового содержания. Выбор времени для одиночного размещения позволил затронутым мышам адаптироваться к социальной изоляции и стабилизировать рост своего веса до вмешательства (Рисунок S4B).

Выращивание

Methylococcus capsulatus Bath (NCIMB 11132) культивировали в среде с нитратными минеральными солями (NMS), как описано ранее ¹⁷ для получения бактериального лизата одного штамма . Аликвоты культуры McB замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C. Культивирование на чашках с агаром и во встряхиваемых колбах (орбитальный шейкер-инкубатор при 200 об / мин) проводили при 45 ° C в атмосфере 75% воздуха 23.25% CH ₄ и 1,25% CO ₂ . Непрерывное культивирование проводили в 3-литровом биореакторе (Applikon, Нидерланды) с рабочим объемом 2 литра. Клетки предварительно культивировали во встряхиваемых колбах и использовали для инокуляции биореактора до оптической плотности 0,1 при 440 нм (OD ₄₄₀ ). Температуру поддерживали на уровне 45 ° C, скорость перемешивания устанавливали на 650 об / мин, а pH поддерживали на уровне 6,8 путем автоматического добавления 2,5 M NaOH / 2,5 M HCl. В биореактор барботировали газовую смесь из 75% воздуха и 25% метана.Непрерывное культивирование было начато после начальной фазы партии, и скорость разведения была установлена ​​на 0,01 ч ^-1 . OD _{, 440,} в устойчивом состоянии обычно поддерживалась на уровне приблизительно 10. Культуральные стоки собирали, и клетки собирали центрифугированием. Стенки бактериальных клеток были разрушены при использовании френч-пресса перед лиофилизацией материала.

Тесты на толерантность к глюкозе и инсулину

Мышей подвергали магнитно-резонансному (МР) сканированию с использованием EchoMRI 4in1 (Техас, США) для определения жировой и мышечной массы в указанные моменты времени (рис. 1A, 4A).Мышей не кормили за 5 или 2 часа до любого перорального теста на толерантность к глюкозе (OGTT) или внутрибрюшинного теста на толерантность к инсулину (ITT), соответственно. Уровень глюкозы в крови натощак измеряли по кровотечению из хвостовой вены с помощью глюкометра Bayer Contour (Bayer Health Care). Впоследствии мышам вводили через зонд 3 мкг глюкозы / г безжировой массы (OGTT) или внутрибрюшинно вводили 0,75 мЕд инсулина / г безжировой массы (ITT). Кровь отбирали в определенные моменты времени для измерения уровня глюкозы в крови и инсулина для оценки глюкорегуляторной способности, включая секрецию инсулина, стимулированную глюкозой (GSIS), как подробно описано в другом месте ¹⁸ .

Измерения короткоцепочечных жирных кислот

Короткоцепочечных жирных кислот (SCFA) определяли газохроматографическим анализом. Фекалии суспендировали в воде MilliQ (1: 1 (мас. / Об.)) И затем гомогенизировали в установке для пробоподготовки FastPrep-96 (MP Biomedicals). Гомогенаты разбавляли 0,4% муравьиной кислотой (1: 1 (об. / Об.)), Переносили в пробирки Эппендорфа и центрифугировали при 13000 об / мин в течение 10 минут. 300 мкл супернатантов наносили на спин-колонки (VWR, размер пор 0,2 мкм) и центрифугировали при 10000 об / мин в течение 5 минут.Элюаты переносили во флаконы для ГХ объемом 300 мкл. Использовался режим раздельного ввода с объемом ввода 0,2 мкл. Газовый хроматограф представлял собой Trace 1310 (Thermo Scientific), оборудованный автосамплером и пламенно-ионизационным детектором. В качестве газа-носителя использовали гелий, а колонка представляла собой Stabilwax (Restek) длиной 30 м с полиэтиленгликолем в качестве неподвижной фазы. Температура инжектора: 250 ° C, температурные интервалы: 2 минуты при 90 ° C, затем повышение на 6 минут до 150 ° C, затем повышение на 2 минуты до 245 ° C и выдержка при этой температуре в течение 4.9 мин. Температура детектора: 275 ° C.

Экстракция РНК и количественная ОТ-ПЦР

Замороженная ткань печени была подвергнута крио-измельчению ступкой и пестиком на жидком азоте, и общая РНК была экстрагирована с помощью TRIreagent (Sigma-Aldrich, США) в соответствии с протоколом производителя с использованием PRECELLYS® 24 для гомогенизации. . Один мкг РНК транскрибировали в кДНК с помощью обратной транскриптазы (Invitrogen, США). Количественные ПЦР-анализы проводили с использованием основной смеси SYBR Green qPCR (Thermo Scientific, США) и системы qPCR Stratagene Mx3000P.Стандартная кривая и контроль без матрицы (NTC) были включены в каждые 96-луночные планшеты. Проверка каждой мишени была основана на Rsq стандартной кривой> 0,995, эффективности усиления 100 ± 10% и единственном пике. Значения Ct для каждой мишени соотносились с контрольными значениями Ct 18S того же образца на 2 ^ΔCt и визуализировались как кратное изменение среднего значения контрольной группы LFD. Последовательности праймеров приведены в таблице S2.

Гистология

Образцы ткани печени брали сразу после эвтаназии, фиксировали в 10% формалине и затем заливали парафином перед разделением на срезы в соответствии со стандартными процедурами световой микроскопии.Толстую кишку опорожняли для содержимого и затем обматывали вокруг иглы 27G, после чего полученные роллы Swizz тщательно консервировали в жидком азоте (завернутые в алюминиевую фольгу) до замачивания парафином. Вложенные ткани вырезали толщиной 2 мкм и помещали на предметные стекла. Эти срезы были дополнительно обработаны и окрашены либо гематоксилином и эозином (H&E), Oil Red O, PAS или HID-AB, либо помечены антителами, представляющими интерес для иммуногистохимических исследований, как подробно описано ниже.Образцы были рандомизированы и закрыты для патологов, выполняющих гистологический анализ.

Печень

Оценка активности неалкогольной жировой болезни печени (NAS)

Срезы печени были подготовлены по стандартным протоколам и впоследствии оценены двумя независимыми наблюдателями слепым методом с использованием установленной шкалы активности НАЖБП (NAS) для оценки H&E окрашенные срезы печени ¹⁹ . Короче говоря, оценка от 0 до 2 исключает неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), оценка от 3 до 4 определяет «пограничный НАСГ», а оценка ≥ 5 считается НАСГ.

Окрашивание Oil Red O

Биопсии печени фиксировали в параформальдегиде, криозащищали поливинилпирролидоном / сахарозой и замораживали в жидком азоте. Криосрезы готовили и окрашивали липид-специфическим Oil red O (Sigma Aldrich, Германия) и анализировали под микроскопом Axio Imager M2. Изображения были получены с помощью цветной камеры Axiocam 506 (Zeiss, Йена, Германия). Площади окрашенных липидов определяли с помощью программного обеспечения ImageJ-1.50i (https://imagej.nih.gov/ij/index.html).

Толстая кишка

Морфологические и морфометрические оценки тканей толстой кишки проводились вслепую, и все измерения проводил один и тот же обученный патолог. Один окрашенный H&E срез толстой кишки от каждого человека оценивали гистологически на наличие каких-либо признаков патологии. Чтобы оценить качество муцинов, ткани толстой кишки окрашивали как на кислые, так и на нейтральные муцины. Нейтральные муцины окрашивали Periodic Acid Schiffs (PAS). Кислые муцины окрашивали с помощью комбинации диамина с высоким содержанием железа (HID) для сульфатированных муцинов (сульфомуцинов) и альцианового синего (AB) для карбоксилированных муцинов (сиаломуцинов).Измерения глубины крипт (CD), а также анализ типа и количества муцина были выполнены на HID / AB- и PAS-окрашенных срезах в трех гистологически различных областях толстой кишки, то есть проксимальной, средней и дистальной области. В каждом из этих трех мест были измерены три крипты с продольным разрезом. Таким образом, каждая точка данных представлена ​​в виде среднего значения трех (тип и количество муцина) или шести (CD) измерений. Крипты отбирались только тогда, когда весь эпителий крипт был виден от lamina muscularis mucosae до просвета.Гистологические срезы толстой кишки исследовали в микроскопе Axio Imager Z2 (Zeiss, Йена, Германия), а цифровые изображения получали с помощью цветной камеры Axiocam 506 (Zeiss, Йена, Германия). Микрофотографии были сделаны с тем же увеличением объектива 20x. Измерения глубины крипты проводились с помощью программы Image J-Fiji version 1.52e Java 1.8.0_181 ²⁰ . Для количественной оценки и автоматической оценки различных типов муцина использовался плагин для деконволюции цвета для программы Image J-Fiji ²¹ .

Липидомия печени

Образцы были рандомизированы и липид экстрагирован, как описано ранее. Короче говоря, 50 мг замороженной ткани гомогенизировали в предварительно охлажденной пробирке объемом 2 мл, добавляли 0,5 мл ледяного 50% MeOH с ~ 40 мкМ D5-триптофана, следуя стандартным протоколам, и хранили при -80 ° C до анализа LCMS. Список пиков, полученный после предварительной обработки (характеристики, определяемые их значением массы / заряда, временем удерживания и площадью пика), был проанализирован в MetaboAnalyst 4. Затем данные были автоматически масштабированы (центрирование среднего значения и деление на квадратный корень из стандартного отклонения каждой переменной) для обеспечения распределения Гаусса, позволяющего относительное сравнение.Одномерный и многомерный анализ выполняли с помощью t-критериев, графика вулканов, дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом HSD Тьюки и анализом главных компонентов (PCA) для обнаружения значимых попаданий и визуального разделения тенденций между группами. Признаки, показывающие аналогичный образец между LFD и WD _McB , были идентифицированы функцией сопоставления с образцом. Затем 25 лучших характеристик были обработаны для идентификации с использованием онлайн-базы данных Lipidmaps (http://lipidmaps.org) с допуском по массе между измеренным значением m / z и точной массой 3 ppm.

Анализ микробиома и биоинформатическая обработка

Свежие образцы фекалий собирали через 3-4 часа светового цикла, мгновенно замораживали и хранили при -80 ° C до последующей обработки. Бактериальную ДНК из образцов фекалий экстрагировали с использованием почвенного набора NucleoSpin (Macherey-Nagel) в соответствии с инструкциями производителя. Амплификацию гена 16S рРНК, подготовку библиотеки и секвенирование выполняли, как описано ранее ²² . Первоначальная обработка данных была выполнена, как описано в другом месте ²³ .Данные были сокращены до 23 107 чтений на образец. Анализ главных координат (PCoA) проводился на основе взвешенного расстояния UniFrac. Для выбора ОТЕ и видов, обогащенных разными подгруппами, использовался DESeq2 ²⁴ с настройками по умолчанию. Относительная численность OTU была агрегирована до уровня родов. Роды, присутствующие в> 1/3 образцов, использовались в тестировании дифференциальной численности. Genera с p.adj. Сообщалось о <0,05 при сравнении последней точки отбора проб для WD _REF / WD _CNTL и WD _McB с анализом дифференциальной экспрессии DESeq2 на основе отрицательного биномиального распределения.Перестановочный многомерный дисперсионный анализ (permanova) с использованием взвешенных матриц расстояний UniFrac (Adonis, пакет Vegan R) использовался для оценки общего микробного состава.

Выделение клеток собственной пластинки тонкой кишки (SI) и толстой кишки (LI)

Фекалии и слизь из LI соскабливали, а SI промывали 1x HBSS (Gibco), содержащим 15 мМ HEPES (Thermo Scientific). Пятна Пея были аккуратно удалены из SI. SI и LI были открыты в продольном направлении, разрезаны на части размером ок.Кусочки размером 1 см и промыли 3 раза 1x HBSS (Gibco), содержащим 15 мМ HEPES (Thermo Scientific), 5% FCS (Viralex ^TM , PAA Laboratories), 50 мкг / мл гентамицина (Gibco) и 2 мМ EDTA (Invitrogen, Life Technologies) в течение 15 мин при 37 ° C. На первом этапе инкубации к образцам LI дополнительно добавляли 0,15 мг / мл DL-дитиотреитола (Sigma-Aldrich). Образцы LI, но не SI, встряхивали на орбитальном шейкере при 350 об / мин во время инкубации. После каждого этапа инкубации образцы SI, но не LI, встряхивали вручную в течение 10 с.Среды, содержащие эпителиальные клетки и дебрис, отбрасывали фильтрованием через сетку 250 мкм (Tekniska Precisionsfilter, JR AB). Оставшуюся ткань расщепляли в течение 25-28 минут при 37 ° C при перемешивании на магнитной мешалке (500 об / мин) в среде R-10 (RPMI 1640 (Gibco) с 10% FCS (Viralex, PAA Laboratories), 10 мМ HEPES (Thermo Scientific). , 100 Ед / мл пенициллина (Gibco), 100 мкг / мл стрептомицина (Gibco), 50 мкг / мл гентамицина (Gibco), 50 мкМ 2-меркаптоэтанола (Gibco) и 1 мМ пирувата натрия (Gibco)), содержащих 1 мг / мл коллагеназа P (Roche) и 0.03 мг / мл ДНКазы I (Roche). После переваривания клетки SI-LP и LI-LP очищали центрифугированием в градиенте плотности (600 rcf в течение 20 мин при 22 ° C, ускорение 5 и тормоз 0) с 40/70% Percoll (GE Healthcare). Затем клеточные суспензии фильтровали через сетчатые фильтры для клеток 100 мкм (BD Biosciences) и повторно стимулировали in vitro перед окрашиванием для проточного цитометрического анализа.

SI-LP и LI-LP клетки повторно стимулировались in vitro , как описано ранее ²⁵ .Вкратце, клетки моделировали в среде R-10 в присутствии либо 20 нг / мл IL-23 (R&D Systems), либо 250 нг / мл PMA (Sigma-Aldrich) в сочетании с 0,5 мкг / мл иономицина (Sigma-Aldrich). в течение 4 часов при 37 ° C. После 1 ч инкубации добавляли 10 мкг / мл брефельдина A (BioLegend).

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия выполнялась в соответствии со стандартными процедурами. Агрегаты клеток (идентифицированные на диаграммах разброса FSC-H по сравнению с FSC-A) и мертвые клетки, идентифицированные с помощью набора Zombie Aqua Fixable Viability Kit (BioLegend), были исключены из анализа.Внутриклеточное окрашивание выполняли с использованием набора буферов для окрашивания eBioscience FoxP3 / транскрипционного фактора (eBioscience) в соответствии с инструкциями производителя. Данные были получены на LSRII (BD Biosciences) и проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star).

Антитела (Abs) и реагенты

В исследовании использовались следующие mAb и реагенты: анти-CD3ε (17A2), анти-CD4 (GK1.5), анти-CD8α (53-6,7), анти-CD11c ( N418), анти-CD19 (6D5), анти-CD45 (30F11), анти-CD45R / B220 (RA3-6B2), анти-CD90.2 (30-h22), анти-CD127 (A7R34), анти-Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), анти-Ter119 (TER-119), анти-TCRβ (H57-597 ), анти-TCRγδ (GL3), анти-NK1.1 (PK136), анти-NKp46 (29A1.4), анти-FoxP3 (FJK-16s), анти-RORγt (B2D), анти-T-bet (4B10 ), анти-IL-17A (TC11-18h20.1), анти-IL-22 (IL22JOP) и анти-IFNγ (XMG1.2). Все Abs были приобретены у eBioscience, BioLegend или BD Biosciences. Стрептавидин, конъюгированный с PECF594, был приобретен у BD Biosciences.

Мультиплексный количественный анализ цитокинов

Ткани печени измельчали ​​пестиком в ступке на жидком азоте.30-40 мг ткани переносили в чистую пробирку и добавляли 400 мкл буфера реагента для экстракции тканевого белка T-PER (Thermo Scientific), включающего ингибиторы протеиназы (Sigma-Aldrich). Концентрацию белка оценивали с помощью BCA (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Цитокины были количественно определены с использованием технологии xMAP с комбинациями предварительно смешанных панелей мышиных цитокинов Bio-Plex Pro (BioRad), и анализы были выполнены на системе Bio-Plex 200 и программном пакете Bio-Plex Manager.

Статистический анализ

Данные Omics были получены, как описано в соответствующих разделах. Остаточные отклонения нормальности оставшихся данных оценивались комплексным методом Д’Аугостино-Пирсона (k2), Graphpad Prism 8, а затем оценивались с помощью параметрических (гауссовское распределение) или непараметрических (негауссовское распределение) тестов, в зависимости от ситуации. Подробная информация о каждом тесте, включая апостериорную оценку, указана в подписях к рисункам. Данные выражены в виде среднего значения ± SEM с отдельными точками, и все группы сравниваются с соответствующей группой WD _REF или WD _CNTL , как указано.

Результаты

Кормление McB отменяет вызванные WD изменения микробиоты кишечника и увеличивает уровни SCFA в слепой кишке.

Чтобы вызвать ожирение и иммунометаболические дисфункции, мышей C57BL / 6JRj первоначально кормили WD с ожирением. После 12 недель кормления WD мышей были разделены на новые группы в зависимости от веса, жировой массы и глюкорегуляторной способности (рис. 1A) и кормили экспериментальных WD в течение дополнительных 6 недель. Хотя известно, что диетический жир вызывает воспроизводимые и липид-зависимые изменения в микробиоме кишечника мышей в различных диетических композициях ²⁶ , о влиянии белка на микробиом известно меньше.Таким образом, чтобы выяснить, повлияет ли диетический белок (то есть казеин по сравнению с лизатами цельноклеточных бактерий) на структуру сообщества микробиоты кишечника, мы проанализировали свеже собранные образцы фекалий до и во время диетического вмешательства. У мышей LFD и WD _REF после 12 недель кормления наблюдались отчетливые профили кишечной микробиоты (исходный уровень вмешательства, неделя 12 + 0; рис. 1B, C), включая примерно в 10 раз меньшую численность видов, способствующих укреплению здоровья, Parasutterella . ²⁷ и Parabacteroides ²⁸ , которым противодействует одинаково увеличившаяся численность родов Desulfivobrio ^{30, 31} , ассоциированных с ожирением (рис. 1D), а также ∼4-кратное увеличение числа Firmicutes с до Соотношение Bacteroidetes (F / B) (рис. 1E).Интересно, что у мышей, которых кормили WD _CNTL , наблюдались незначительные изменения в сигнатуре микробиома в течение 6 недель вмешательства (рис. 1B-F и S1A-B), что позволяет предположить, что добавленный источник липидов имел ограниченное влияние на экологию кишечника. В отличие от этого наблюдения, мы отметили явное изменение бактериального состава у мышей, получавших WD _McB . В течение первых 2 недель лечения общая структура сообщества у этих мышей сместилась в сторону их коллег, получавших LFD (рис. 1B-F, таблица S3).Затем мы спросили, связаны ли наблюдаемые таксономические различия между группами с изменениями функционального потенциала. SCFAs являются основными конечными продуктами метаболизируемых волокон и, в меньшей степени, аминокислотами, ускользающими от переваривания в SI, с огромным влиянием на физиологию хозяина ^{32, 33} . Наивысшие уровни SCFAs обнаружены в слепой и проксимальной части толстой кишки ³⁴ . Поэтому мы исследовали, были ли уровни SCFA в слепой кишке разными в разных группах. Мы обнаружили последовательное увеличение уровней трех основных, а также трех второстепенных классов SCFA в слепой кишке мышей, получавших WD _McB , по сравнению с аналогами, получавшими WD _CNTL , что указывает на не только таксономически, но и функционально дискретную микробиоту. профили в двух группах мышей, подтверждающие положительное влияние на здоровье включения лизатов McB в рацион (рис. 1G-H).

WD

Сложная взаимосвязь между кишечными микробами и иммунитетом хозяина в сочетании с иммунорегуляторной способностью SCFAs ³⁵ побудила нас исследовать, опосредованы ли наблюдаемые изменения, опосредованными WD. _{Кормление McB} было связано с иммунными нарушениями.

Соответственно, мы проанализировали профиль иммунных клеток SI-LP и LI-LP в подгруппе экспериментальных мышей (n = 6-10 / группа) с использованием многоцветной проточной цитометрии, уделяя особое внимание фенотипической характеристике врожденных лимфоидных клеток группы 3 (ILC3). естественные клетки-киллеры (NK) и Т-клетки (стратегии стробирования см. на Рисунке S2A-B).Количество ILC3, NK-клеток и Т-клеточного рецептора (TCR) -γδ ⁺ T-клеток было одинаковым между группами (рисунок S2C-E). То же самое верно для количества TCRβ ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток, а также для доли Т-хелперов (T _H ) 1-, T _H 17- и _n T _regs ячеек (рис. 2A-B).

A-D) Количество указанных клеток в толстой кишке из Exp1 (◆) и Exp2 (●).EG) Репрезентативные графики TCRb ободочной кишки ⁺ CD4 ⁺ FoxP3 ⁺ RORγt ⁺ _p T _regs (слева) и IL17 ⁺ _p T _regs (справа) в LFD ( E), WD _CNTL (F) и WD _McB (G). H-K) Количество указанных клеток в тонком кишечнике из Exp1 (◆) и Exp2 (●). LN) TCRb ⁺ CD4 ⁺ FoxP3 ⁺ RORγt ⁺ _p T _regs (слева) и IL17 ⁺ _p T _regs (справа) в LFD (L) , Группа WD _CNTL (M) и WD _McB (N). A-N) n = от 6 (LFD) до 10 (WD _McB и WD _CNTL ). A-D, H-K) Статистически значимые отличия от группы WD _CNTL с помощью однофакторного дисперсионного анализа с множественными сравнениями и апостериорного анализа Даннета обозначены *. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Интересно, что доля _p T _regs была более чем в 2 раза увеличена в LI-LP мышей, получавших WD _McB , по сравнению с аналогами, получавшими WD _CNTL (Рисунок 2C, p <0.001). Примечательно, что эта подгруппа регуляторных Т-клеток, как было показано, сдерживает воспаление кишечника ¹² и опосредует иммунологическую толерантность к кишечному патобионту Helicobactor hepaticus , тем самым защищая от T _H 17-опосредованной дисфункции барьера и последующего колита ³⁶ . Поскольку RORγt является отличительным фактором транскрипции для дифференцировки клеток T _H 17 и необходим для выработки ими IL-17, мы затем оценили, способны ли _p T _regs , индуцированные различными диетами, также экспрессировать IL-17.Действительно, ex vivo стимулированный LI-LP _p T _regs продуцировал значительные и зависящие от диеты количества белка IL-17 (фигура 2D-G, p <0,001). Аналогичный фенотип наблюдался в SI-LP (рис. 2H-N), где _p T _regs у мышей, которых кормили WD _McB , достигало ~ 3-кратного увеличения по сравнению с мышами, которых кормили WD _CNTL (рис. 2J , p <0,001).

WD

Измененный иммунный профиль в сочетании со сдвигом микробиоты кишечника в сторону состояния, аналогичного тому, которое наблюдается у мышей, получавших тощие LFD, потенциально может вызвать перекрестные помехи с органами глюкорегуляции.Чтобы проверить, могут ли лизаты McB обратить нарушенную регуляцию глюкозы, мы выполнили OGTT и оценили GSIS, сопутствующие составу массы тела у мышей с ожирением, получавших WD _REF , в течение 11 недель и после 5 недель диетического вмешательства с учетом временного анализа (Рисунок 1A). Все мыши были разделены на экспериментальные группы на основе их глюкорегуляторной способности до вмешательства (рисунок S3A-B). В то время как реакция на провокацию глюкозой оставалась в значительной степени неизменной с 11-й по 12-ю + 5-ю недели, независимо от экспериментальной диеты (рис. 3A-C), как уровни инсулина 5-часового голодания, так и стимулированные глюкозой ответы инсулина были значительно увеличены у мышей, получавших WD _CNTL ( Рисунок 3E, p <0.01 & p <0,001 соответственно) в соответствии с нашим предыдущим отчетом о зависимых от времени изменениях в регуляции глюкозы ³⁷ . Мыши, получавшие корм LFD и WD _McB , были полностью защищены от этой пагубной траектории (рис. 3D, F и S3C, p = 0,24 и 0,68, соответственно), а мыши, получавшие корм WD _McB , также демонстрировали умеренно улучшенную чувствительность к инсулину на основе 5-часовая гликемия натощак (Рисунок 3C, p <0,05) и тест на толерантность к инсулину внутрибрюшинно (Рисунок 3G, p <0.05).

AC) Пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT) и определение уровня глюкозы в крови натощак за 5 часов до диетического вмешательства (11-я неделя) и через 5 недель после вмешательства (неделя). 12 + 5) групп LFD (A), WD _CNTL (B) и WD _McB (C), показывающих среднее значение ± SEM двух независимых экспериментов. DF) Стимулированная глюкозой концентрация инсулина во время OGTT и уровни инсулина натощак через 5 часов до диетического вмешательства (11 неделя) и через 5 недель после вмешательства (неделя 12 + 5) LFD (D), WD _CNTL (E) и Группы WD _McB (F), показывающие среднее значение ± SEM двух независимых экспериментов. G) Интраперитонеальный тест на толерантность к инсулину (ITT) через 3 недели после диетического вмешательства, показывающий среднее значение ± SEM. H) Увеличение массы тела. Мышей кормили либо LFD, либо WD _REF в течение первых 12 недель с последующим 6-недельным периодом диетического вмешательства, показывающим среднее значение ± SEM двух независимых экспериментов. Пунктирная вертикальная линия обозначает начало вмешательства. I) Жировая масса в граммах в течение периода диетического вмешательства (неделя 12 + 0–12 + 6), измеренная с помощью МРТ-сканирования, показывающая среднее значение ± SEM двух независимых экспериментов. J) Среднее потребление корма на клетку в граммах на мышь в течение 48 часов в Exp1 (◆) и Exp2 (●). K) Содержание жира и белка в кале в Exp1 (◆) и Exp2 (●). L) Оценка активности НАЖБП на основе степени стеатоза печени (0-3), воспаления (0-2) и гепатоцеллюлярного раздува (0-3) по степени слепой гистологической оценки ткани печени в Exp1 (◆) и Exp2 (●) . M) Типичное окрашивание H&E ткани печени из указанной экспериментальной группы. A-F) n = от 6 (LFD) до 15 (WD _McB и WD _CNTL ).Статистическая значимость в каждой временной точке обозначена знаком * при парном двустороннем ANOVA-RM с апостериорным тестом Бонферрони. Уровни глюкозы и инсулина натощак оценивали с помощью парных t-критериев. G) n = от 8 (WD _McB ) до 9 (WD _CNTL ). Статистическая значимость в каждой временной точке обозначена знаком * во время двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA-RM с апостериорным тестом Бонферрони. H-I) от n = от 6 (LFD) до 15 (WD _McB и WD _CNTL ). Статистическая значимость обозначена *.LFD и WD _McB сравнивали с WD _CNTL с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA-RM, скорректированного с учетом множественных сравнений с помощью апостериорного анализа Даннета. J-K) Каждая точка данных похожа на среднее значение для одной клетки. n = от 2 (LFD) до 5 (WD _McB и WD _CNTL ). Статистическая значимость обозначена *. LFD и WD _McB сравнивали с WD _CNTL с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA-RM, скорректированного с учетом множественных сравнений с помощью апостериорного анализа Даннета. L) n = от 6 (LFD) до 13 (WD _McB и WD _CNTL ).Статистическая значимость обозначена *. LFD и WD _McB были сравнены с WD _CNTL Краскалом-Уоллисом, скорректированным с учетом множественных сравнений, сделанных постфактум Данна. A-L) * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

В целом увеличение веса имитировало глюкорегуляторную способность. Таким образом, мыши, получавшие корм WD _McB , демонстрировали стабильность веса, жировой массы и мышечной массы при переходе на экспериментальную диету, в отличие от непрерывного роста массы и массы жира у мышей, которых кормили WD _CNTL (рис. 3H-I и S3D).Отсутствие прибавки в весе не объяснялось снижением потребления корма (рис. 3J), а скорее, по-видимому, было связано с повышенной секрецией каловой энергии (рис. 3J-K). Поскольку ожирение и нарушение регуляции глюкозы тесно связаны с НАЖБП ³⁸ , мы затем подвергли залитые парафином срезы печени гистологической оценке. Эти анализы выявили уменьшение стеатоза и гепатоцеллюлярного раздувания у мышей, получавших WD _McB , по сравнению с аналогами, получавшими WD _CNTL-, где особенно гепатоцеллюлярный раздувание было остановлено (или возвращено) в состояние, напоминающее состояние у мышей, получавших тощие LFD (рис. 3L). -М, р <0.05). Важно отметить, что гепатоцеллюлярный баллон играет важную роль в развитии более тяжелого заболевания печени, NASH ³⁸ .

Кормление WD

A) Схема исследования с начальной западной диетой (WD _REF ) при кормлении в течение 21 недели при 30 ° C. Тест на толерантность к инсулину (ITT) и состав тела с помощью МРТ-сканирования оценивали через 20 недель для разделения групп () с последующим диетическим вмешательством в течение 5 недель кормления либо WD _REF , либо WD, включая лизат McB (WD _McB ). Контрольную группу, получавшую низкожировую диету (LFD), использовали на протяжении всего эксперимента (от 0 до 21 + 5 недель).Состав тела, ITT и отбор свежих фекалий проводились через указанные интервалы. Первые 12 недель мышей содержали вместе, а затем разделили по отдельным клеткам. B) Уровни инсулина в плазме крови через 5 часов натощак до (20-я неделя) и после (21 + 5-я недели) диетического вмешательства. C) Жировая масса в граммах, измеренная с помощью магнитно-резонансной томографии в указанные моменты времени после диетического вмешательства. D) Оценка активности НАЖБП, разделенная на степень стеатоза печени (0–3), воспаление (0–2) и гепатоцеллюлярный баллон (0–3), оцененные путем слепой гистологической оценки ткани печени, окрашенной H&E. E) Типичное окрашивание H&E ткани печени из указанной экспериментальной группы. F) Количество липидных капель в каждом из 3-4 образцов печени на экспериментальную группу, определенное количественно окрашиванием Oil Red O. G) Средний размер липидных капель в каждом из 3-4 образцов печени на экспериментальную группу, количественно определяемый окрашиванием Oil Red O. H) Распределение размера липидных капель в% от всех липидных капель в каждой экспериментальной группе. I) Концентрация адипонектина в плазме у мышей, голодавших в течение 5 часов, до (20-я неделя) и после (21 + 5-я недели) диетического вмешательства. J) ITT после четырех недель диетического вмешательства (21 + 4 недели). K) Экспрессия ключевых метаболических ферментов в ткани печени после пяти недель диетического вмешательства (недели 21 + 5) с помощью RT-qPCR. B + I) n = 6-9 на группу. Статистическая значимость обозначена * в парном t-тесте. D + K) n = 8-10 на группу. Статистическая значимость по сравнению с WD _REF по критерию Краскела-Уоллиса, скорректированная с учетом множественных сравнений по апостериорной оценке Данна. F-H) n = 3 случайно выбранных образца на группу.Статистическая значимость по сравнению с WD _REF по критерию Краскела-Уоллиса, скорректированная с учетом множественных сравнений по апостериорной оценке Данна. C + J) n = 9-10 на группу. Статистическая значимость по сравнению с WD _REF с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA-RM, скорректированного с учетом множественных сравнений по Даннету post hoc. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Затем мы оценили липидом печени с помощью масс-спектрометрии (МС / МС), чтобы выяснить, связано ли уменьшение НАЖБП с измененным липидным профилем.Путем сравнения WD _McB и WD _REF мы идентифицировали 57 и 279 дифференциально регулируемых пиков в режиме отрицательной и положительной ионизации соответственно (рис. 5A-B, S5A-B, все FDR <0,05). Из них наиболее классифицированные липиды были заменены на WD _McB в направлении мышей, получавших LFD (рис. 5C-D). Примечательно, что 57% видов с повышенной регуляцией были жирными кислотами с нечетной цепью, в то время как 80% видов с пониженной регуляцией представляли липиды с четным числом атомов углерода (рис. 5C-D и таблица S4), что подтверждает предыдущие отчеты, где нечетная, а не четная цепь. жирные кислоты обратно пропорциональны инсулинорезистентности человека ⁹ и диабету 2 типа ⁴² .

A) Анализ основных координат (PCoA) липидов печени, идентифицированных в режиме отрицательной ионизации. B) То же, что и в A, но изображено на графике вулкана со значительно регулируемыми видами липидов (FDR <0,05), представленными по шкале log2 либо зеленым (WD _McB > WD _REF ), либо синим (WD _McB < WD _REF ). C-D) Идентифицированные виды липидов, дифференциально экспрессируемые (FDR <0,01) между WD _McB и WD _REF , как указано. Изменения складок и скорректированные значения p для отдельных видов липидов указаны в таблице S4. E) Пути Lipd, идентифицированные с помощью анализа кратности изменения, отделяющего группы LFD (серый) и WD _McB (зеленый) от WD _REF в режиме отрицательной ионизации. F) Уровни печеночных цитокинов TNF-α и IL-6, как указано. G) Ly6G ⁺ и CD3 ⁺ иммунные клетки, выявленные иммуногистохимическим методом. H) Уровни цитокинов в плазме IL-22, IL-18 и IL-17. F + H) n = 8-10. Статистическая значимость по сравнению с группой WD _REF с помощью теста Краскела-Уоллиса, скорректированного с учетом множественных сравнений с помощью апостериорного анализа Данна. G) n = 3 на группу (выбранные случайным образом). Статистическая значимость по сравнению с WD _REF с помощью однофакторного дисперсионного анализа, скорректированного для множественных сравнений методом Dunnett post hoc. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Чтобы оценить функциональные последствия изменения липидного профиля, мы использовали базу данных Lipidmaps для выявления затронутых путей и нанесли наблюдаемые изменения в шкалу log ₂ , сравнивая LFD и WD _McB с WD _REF .Большинство пораженных путей аналогично регулировались как по направлению, так и по величине у мышей LFD и WD _McB по сравнению с мышами WD _REF (рис. 5E и S5C). Следует отметить, что желчные кислоты и церамиды, оба из которых были значительно подавлены у мышей, получавших WD _McB , по сравнению с аналогами, получавшими WD _REF , как было показано, опосредуют стеатогепатит за счет повышения уровня IL-6 и TNF-α, соответственно ^{43 , 44} . Поэтому мы измерили эти печеночные цитокины и наблюдали аналогичное снижение уровней как в LFD, так и в WD _McB по сравнению с WD _REF (рис. 5F).

Ключевой особенностью патологий печени, вызванных диетой, включая НАЖБП, является привлечение вновь активированных иммунных клеток, способных вызывать провоспалительный иммунный ответ. Этот процесс обычно затруднен у мышей, содержащихся в условиях умеренного теплового стресса, что, следовательно, не в состоянии фенокопировать патофизиологию человека. Однако термонейтральное содержание воспроизводит некоторые черты человеческого заболевания ⁴⁵ , которые в сочетании с кормлением HFD усиливают внутрипеченочную инфильтрацию провоспалительных моноцитов Ly6 ^{high 46} .Эти моноциты взаимодействуют с резидентными Т-клетками ткани и играют центральную роль в патогенезе повреждения печени, следовательно, представляют собой привлекательную терапевтическую мишень для смягчения развития НАЖБП и сокращения ассоциированных патологий ^{44 ​​}.

Таким образом, мы подвергли ткани печени репрезентативных мышей иммунологической оценке с помощью иммуногистохимии и наблюдали заметное снижение как Т-клеток CD3 ⁺ , так и моноцитов Ly6 ^high у мышей, питающихся WD _McB , по сравнению с их WD _REF – скармливаемые аналоги (рис. 5G).Уменьшение печеночной иммунной инфильтрации отражалось повышенными уровнями циркулирующих IL-22, IL-18 и IL-17 у мышей, получавших WD _McB , по сравнению с их аналогами, получавшими WD _REF (рис. 5H, p <0,01, < 0,05 и <0,05 соответственно).

WD

Улучшенный фенотип печени побудил нас к дальнейшему исследованию потенциальных признаков в оси кишечник-печень.Первоначально мы оценили, связаны ли наблюдаемые цитокиновые ответы с улучшением здоровья кишечника у мышей, содержащихся в T _{30 ° C} , где ожидается усиление воспаления ⁴⁵ . Действительно, мыши, получавшие WD _McB , были устойчивы к индуцированному WD укорочению толстой кишки, тесно связанному с воспалением толстой кишки (фиг. 6A).

A) Длина толстой кишки в сантиметрах. B) Площадь нейтральных муцинов, определяемая окрашиванием периодической кислотой Шиффа (PAS) в трех конкретных местах, то есть в проксимальном, среднем и дистальном сегментах толстой кишки. В каждом образце (одна точка данных) в каждом месте были измерены три продольно разрезанных крипты. C) Глубина крипт толстой кишки (CD) в проксимальном, среднем и дистальном сегментах толстой кишки, измеренная на гистологических срезах. Измерения даны в мкм, а результаты представлены как средние по шести измерениям крипт на каждое местоположение на каждой отдельной мыши (3 продольно окрашенных PAS и окрашенных HID-AB крипты, соответственно, на каждую точку данных). D) Окрашивание PAS слизи в средних сегментах толстой кишки, репрезентативные гистологические срезы из трех экспериментальных групп, как указано. E) Область сульфомуцинов в проксимальном, среднем и дистальном сегментах толстой кишки по окрашиванию HID. В каждом образце и в каждом месте были измерены три крипты с продольным разрезом. F) Область сиаломуцинов в проксимальном, среднем и дистальном сегментах толстой кишки по окрашиванию AB. В каждом образце и в каждом месте были измерены три крипты с продольным разрезом. G) Типичное окрашивание HID-AB среднего сегмента указанной экспериментальной группы. H) PCoA состава фекальной микробиоты указанной группы до (21 + 0 неделя) и после (21 + 5) диетического вмешательства со средними значениями группы, указанными в виде центроидов. Состав микробиоты значительно отличался между группами WD _REF и WD _McB в конце 21 + 5-й недели эксперимента (PERMANOVA p = 0,001) I) TaxaСводка наиболее распространенных родов бактерий, показывающая среднюю относительную численность указанных родов. в каждой группе в указанный момент времени. J) Отношение Firmicutes / Bacteroidetes в образцах фекалий отдельных мышей при прекращении (21 + 5-я неделя). K) Deseq-анализ численности родов фекальных бактерий, значительно регулируемых вмешательством McB (p.adj. <0,05). Относительная численность в% в каждой группе и вариация показаны для каждого регулируемого рода в выбранные временные точки. Изменения складок и скорректированные значения p для отдельных родов указаны в таблице S5. A-K ) n = 8-10. A-C, E-J) Статистическая значимость по сравнению с группой WD _REF с помощью однофакторного дисперсионного анализа или теста Краскела-Уоллиса (в зависимости от распределения Гаусса) с множественными сравнениями с помощью Даннета или post hoc Данна, соответственно.* = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Чтобы получить дополнительную информацию об иммуномодулирующих свойствах лизатов McB, мы сосредоточили внимание на производстве и функционировании слизи. Поскольку выработка муцина является конститутивным процессом, в котором секреция и прилипание постоянно происходят и быстро приспосабливаются к изменениям окружающей среды, иммуногистохимическая маркировка различных эпитопов MUC может не полностью воспроизводить физические свойства слизи. Поэтому мы применили специализированное гистохимическое окрашивание муцина, что позволило нам различать нейтральный и кислый муцины в соответствии с чистым зарядом каждой молекулы.Кислые муцины были далее разделены на сульфомуцины и сиаломуцины. Разделы показали, что регуляция нейтральных муцинов в бокаловидных клетках, находящихся в крипте, у мышей, получавших WD _REF , последовательно снижалась по сравнению с аналогами, получавшими LFD, в трех четко определенных сегментах толстой кишки; то есть проксимальная, средняя и дистальная области (Рисунок 6B, D). Кормление WD _McB не только полностью изменило эту картину во всех трех сегментах, но даже увеличило выработку нейтральных муцинов, превышающую уровни, обнаруженные у аналогов, получавших LFD.Это замечательное открытие, учитывая постоянное потребление западной диеты с высоким содержанием жиров и сахарозы, которые, как известно, препятствуют функции бокаловидных клеток. Затем мы оценили глубину крипты (CD) в окрашенных срезах. В то время как CD проксимальной и дистальной части толстой кишки в значительной степени не зависели от диеты, мы наблюдали повышенную CD в среднем сегменте мышей WD _McB , которых кормили (рис. 6C). WD _McB – кормление дополнительно усиливало паттерн гликозилирования, особенно в среднем сегменте толстой кишки, где эта группа демонстрировала 3-кратное увеличение сульфомуцинов, уравновешенное аналогичным (~ 2-кратным) снижением сиаломуцинов по сравнению с WD _REF -кормленные мыши (рис. 6E-G).Никаких различий между мышами, получавшими WD _REF и LFD, не наблюдалось, что указывает на то, что реципрокная регуляция статуса гликозилирования муцина была специфичной для кормления WD _McB .

С акцентом на динамические взаимодействия между иммунитетом кишечника, гликозилированием муцина и комменсальными микробами ⁴⁷ , мы затем оценили состав микробиоты кишечника в временно разделенных образцах. Это было сделано, чтобы определить, были ли изменения микробиоты кишечника, напоминающие микробиоту худых мышей, получавших LFD, были воспроизведены в этой усиленной установке.В отличие от первой серии экспериментов, в которых мы использовали спаренных мышей, демонстрирующих устойчивые профили микробиоты, теперь мы использовали одиночных мышей, чтобы исследовать, были ли опосредованные WD _McB структуры сообщества достаточно устойчивыми, чтобы вызывать последовательные изменения в большей части тела. динамические сообщества одноквартирных мышей. Подобно нашим первым экспериментам при T _{22 ° C} , мы наблюдали нормализацию микробиома кишечника мышей, получавших WD _McB , несмотря на длительное кормление WD до вмешательства (рис. 6H-K).Изменения, вызванные WD _McB , на удивление согласуются с первой серией экспериментов, включая значительно более низкое соотношение F / B (рис. 6J и S5D) и существенное сокращение численности Desulfovibrio , которому противодействует аналогичное расцветание . Роды Parasutterella и Parabacteroides (Рисунок 6K, Таблица S5). Следует отметить, что возрастное увеличение численности Desulfovibrio , о котором недавно сообщалось, ³⁰ было подтверждено в этом исследовании, где общая величина у мышей, получавших WD _REF и LFD, увеличилась в 2-3 раза за 5 недель вмешательства (Рисунок 6K).Кормление WD _McB полностью предотвратило эту траекторию, и парный анализ даже выявил пониженную относительную численность Desulfovibrio у этих мышей.

Обсуждение

В этом отчете мы исследовали взаимосвязь между пищевыми питательными веществами и взаимодействиями хозяина и микробов с акцентом на скорость иммунометаболического ответа в контексте кормления с высоким содержанием жиров и сахарозы. Мы обнаружили лизаты целых клеток из некомменсальных метанотрофных бактерий McB, способных полностью изменить характерные признаки кормления WD, несмотря на продолжающееся потребление диеты, вызывающей ожирение.Сигнатуры включали уменьшение жировой массы, улучшение кишечного иммунитета и глюкорегуляторной способности, сопровождаемые структурами микробного сообщества кишечника, напоминающими таковые у коллег, получавших постное питание LFD.

Недавно было показано, что аномальный состав микробиоты, связанный с ожирением, отражает потребление HFD, а не ожирение per se ⁴⁸ . Поэтому стоит отметить, что нам удалось нормализовать дисрегулируемый микробиом кишечника у мышей, оставшихся на западной диете с высоким содержанием жиров и сахарозы; особенно с учетом того, что изменение жирных диетических привычек у людей с ожирением, связанных с образом жизни, остается клинической проблемой.Это замечательное изменение было воспроизведено в двух различных субштаммах мышей, происходящих от разных производителей, что подтверждает устойчивый фенотип, на который не оказывает заметного влияния исходный состав микробиоты. С этой целью в предыдущем отчете об устойчивом микробиоме приводились доводы в пользу длительной нормализации ⁴⁹ . Это исследование показало, что мыши, переведенные на диету с низким содержанием жиров и клетчаткой после 12 недель кормления HFD, сместили их микробиоту в сторону контрольных мышей соответствующего возраста в течение 4 недель, но полностью сошлись только через 10 недель после изменения диеты.Это особенно интересно, поскольку пищевые волокна, как известно, являются наиболее мощным диетическим регулятором микробиоты кишечника ⁵⁰ , намного превосходя диетический жир ⁵¹ . Тем не менее, в наших руках кормление WD _McB смогло обратить вспять микробиом ожирения более быстрыми темпами, чем кормовая диета в предыдущем отчете ⁴⁹ , несмотря на одинаковое содержание клетчатки в двух WD. Мы также показали, что изменение черт микробиоты воспроизводимо при различных температурах, изменении контрольных рационов, изменении продолжительности эксперимента и у мышей как в одном помещении, так и в одном помещении; все они являются известными модуляторами структур сообщества кишечной микробиоты.В то время как многие роды были одинаково затронуты между экспериментами, другие были либо регулируются исключительно при T _{30 ° C} (например, Bifidobacterium ) или менее выражены при T _{30 ° C} (например, Barnesiella ), что предполагает необязательность для эти специфические микробы в признаках метаболических заболеваний, наблюдаемых в этой модели. Аналогичные наблюдения были сделаны для Akkermansia , который был в ~ 3 раза активирован при T _{30 ° C} , но подвергся несогласованному воздействию (log2 FC отскакивал от +9.От 3 до -10,4) между двумя повторными исследованиями при T _{22 ° C} с выраженными внутригрупповыми вариациями.

В отличие от этих несоответствий, имело место последовательное подавление активности Desulfovibrio , сопровождаемое> 10-кратной активацией Parabacteroides и Parasutterella , что свидетельствует о том, что кормление WD _McB питает благоприятную микробиоту, хотя механически описано. Тем не менее, недавно было показано, что Desulfovibrio процветает у старых мышей с ослабленным иммунитетом и ожирением с нарушенной регуляцией глюкозы ³⁰ .Как потеря Т-клеток, так и введение Desulfovibrio per se вызвали инсулинорезистентность, вызванную ожирением ³⁰ . Кроме того, было показано, что эта бактерия процветает в десульфированной слизистой оболочке толстой кишки, ассоциированной с колитом человека ⁵² и мыши ⁵³ . В совокупности эти наблюдения подтверждают гипотезу о механистической связи между опосредованным WD _McB снижением Desulfovibrio и наблюдаемыми улучшениями хемотипа муцина и скорости метаболического ответа.

Будущие исследования необходимы для выяснения того, были ли изменения кишечной микробиоты, наблюдаемые у мышей, получавших WD _McB , результатом уникального источника питательных веществ, или этому способствовал WD _McB , индуцированный _p T _regs . Следует отметить, что бокаловидные клетки, продуцирующие муцин, способны доставлять люминальные антигены к LP-проживающим дендритным клеткам (DC) ⁵⁴ , способствующим поляризации Т-клеток ⁵⁵ . Поскольку McB сильно индуцирует маркеры созревания DC in vitro – даже превосходя эффекты хорошо описанного пробиотического штамма, Escherichia coli Nissle 1917 ⁵⁶ – мы прогнозируем прямую связь между потреблением McB и соответствующим иммунным профилем.В дополнение к прямой связи, предложенной здесь, потребление McB может также косвенно способствовать поляризации T _reg через расширенные SCFAs ⁵⁷ . Эти важные метаболиты также поддерживают выработку слизи и способствуют взаимодействию тканей в оси кишечник-печень ² . В соответствии с этим представлением мы наблюдали снижение уровней печеночных желчных кислот и TNF-α в сочетании с выраженным снижением внутрипеченочных CD3 ⁺ и Ly-6C ^high клеток. Важно отметить, что в то время как клетки Ly-6C ^high представляют провоспалительные, фиброгенные макрофаги ⁵⁸ , их in situ дифференцируются в клетки Ly-6C ^{low 59} способствуют восстановлению тканей и улучшают прогноз НАСГ ⁶⁰ .Все упомянутые мишени предлагаются в качестве подходящих стратегий для сдерживания НАЖБП и более терминального заболевания печени, NASH ^{44 ​​}.

Существенные, последовательные и глобальные изменения в иммунометаболическом профиле, обнаруженные в этом исследовании, указывают на клинический потенциал в случае их дальнейшего развития. Примечательно, что только в одном исследовании ранее удалось вызвать _p T _regs , и это было ограничено LI-LP ¹¹ . Помимо индукции этой клеточной субпопуляции во всем желудочно-кишечном тракте, мы также показали, что эти клетки проявляли повышенную секреторную способность IL-17 у мышей, получавших WD _McB , по сравнению с их аналогами, получавшими WD _CNTL .С этой целью появляются новые данные, указывающие на то, что ненормативные аналоги _p T _regs , то есть T _H 17 клеток, очищены от SI-LP у мышей DIO ¹⁴ и что повторное введение ex vivo дифференцировалось Тропные клетки кишечника T _H 17 сдерживают развитие ожирения, тем самым улучшая чувствительность к инсулину ¹⁵ .

То, что IL-17 в этом вмешательстве продуцируется клетками T _regs , а не T _H 17, может дополнительно улучшить профиль безопасности предполагаемого лекарства, поскольку физиологическое воздействие и свойства клеток T _H 17 зависят от контекста. -зависимый.Таким образом, клетки T _H 17 могут усиливать воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) у людей с нарушенной барьерной функцией ⁶¹ , тогда как _p T _regs продемонстрировали повышенную подавляющую способность против того же заболевания ¹² . Это уместная особенность, учитывая относительно высокую долю субъектов с метаболическими осложнениями, одновременно страдающих ВЗК ⁶² . Хотя наше исследование не было разработано для оценки восприимчивости к ВЗК, хорошо известно, что очищенные диеты нарушают барьерную функцию ^{50, 63, 64} и, таким образом, представляют клинические признаки ВЗК (причину заболевания), предшествующие воспалению (симптому) ⁶⁵ .Поэтому стоит отметить, что помимо иммуномодулирующего фенотипа, кормление WD _McB увеличивало выработку нейтральной слизи во всех сегментах толстой кишки, в то же время усиливая защитные от ВЗК сульфомуцины, особенно в среднем сегменте. В этом сегменте мы также обнаружили повышенный уровень CD у мышей, получавших корм McB, что в совокупности указывает на усиление барьерной функции.

Таким образом, это исследование демонстрирует последовательную активацию Foxp3 ⁺ RORγt ⁺ IL-17 ⁺ тройной положительный pT _regs по всему желудочно-кишечному тракту и реверсию дисбактериоза кишечника в ответ на WD _McB – кормление, даже в контексте высокого потребления жиров и сахарозы.Перспективы использования бактериальных лизатов в качестве альтернативы традиционным живым пробиотикам заслуживают дальнейшего изучения, так же как и будущие исследования, необходимые для оценки того, в какой степени наши результаты могут быть перенесены на людей. Также срочно необходимы дальнейшие исследования для определения биологической эффекторной молекулы (молекул), содержащейся в этом бактериальном лизате, что позволит впоследствии разработать универсальный медицинский продукт (ы), восстанавливающий баланс кишечного иммунитета и одновременно направленный на дисбактериоз кишечника и метаболические нарушения.

Дополнительная цифра S1: A) Taxasсводка наиболее распространенных бактериальных родов, показывающая среднюю относительную численность в% указанного семейства и родов в каждой группе в указанный момент времени. B) Deseq-анализ численности родов фекальных бактерий, значительно регулируемых вмешательством McB по сравнению с WD _CNTL (p.adj. <0,05). Относительная численность в% в каждой группе и вариация показаны для каждого регулируемого рода в выбранные временные точки. Изменения кратности и скорректированные значения p для индивидуума указаны в таблице S3.

Дополнительная фигура S2: A) Стратегия гейтирования для врожденных лимфоидных клеток группы 3 (ILC3). Репрезентативные графики проточной цитометрии ex vivo стимулированных клеток тонкой кишки (SI) lamina propria (LP). ILC3 были гейтированы как отдельные живые клетки, линия 1 ^– линия 2 ^– CD90.2 ⁺ CD127int / ⁺ RORγδ ⁺ клеток. Показаны репрезентативные данные для RORγδ + ILC3s после стимуляции с (без) IL-23 или без него. Линия 1: CD11c, CD19, CD45R / B220, Ly-6G / Ly-6C (Gr-1), Ter119, NK1.1; Lineage2: CD3ε, CD8α, TCRβ, TCRγδ. B) Стратегия гейтирования для NK-клеток и Т-клеток. Репрезентативные графики проточной цитометрии ex vivo стимулировали клетки собственной пластинки толстой кишки. NK-клетки были гейтированы как одиночные, живые клетки, CD8α ^– CD45 ⁺ NK1.1 ⁺ ; TCRγδ ⁺ Т-клетки были гейтированы как одиночные, живые клетки, CD8α ^– CD45 ⁺ TCRγδ ⁺ CD4 ^– ; CD4 ⁺ T _H 1 клетки гейтировали как отдельные живые клетки, CD8α ^– CD45 ⁺ TCRβ ⁺ CD4 ⁺ T-bet + IFNγ ⁺ ; Клетки CD4 ⁺ T _H 17 были гейтированы как отдельные живые клетки, CD8α ^– CD45 ⁺ TCRβ ⁺ CD4 ⁺ RORγδ ⁺ IL-17A ⁺ .Природные регуляторные Т-клетки ( _n T _regs ) были гейтированы как отдельные живые клетки, CD8α ^– CD45 ⁺ TCRβ ⁺ CD4 ⁺ FoxP3 ⁺ RORγδ ^– и периферически индуцированные регуляторные Т-клетки ( _p T _regs ) были гейтированы как отдельные живые клетки, CD8α ^– CD45 ⁺ TCRβ ⁺ CD4 ⁺ FoxP3 ⁺ RORγδ ⁺ . Показаны репрезентативные данные TCRβ ⁺ CD4 ⁺ Т-клеток после стимуляции с или без (без) PMA и иономицина (PMA / Iono). C) Число клеток ILC3 в толстой кишке (LI) -LP и SI-LP. D) Номер ячейки NK1.1 в LI-LP и SI-LP. E) TCRγδ ⁺ CD4 ^– количество клеток в LI-LP и SI-LP. C-E) Показаны отдельные значения из Exp1 (◆) и Exp2 (●) и статистически значимые различия с WD _CNTL с помощью одностороннего дисперсионного анализа, скорректированного для множественных сравнений с помощью апостериорного анализа Даннета. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Дополнительная цифра S3: A-B) Значения глюкозы в крови и инсулина плазмы, соответственно, во время перорального теста на толерантность к глюкозе (OGTT) перед диетическим вмешательством (неделя 11).Среднее значение ± SEM показано для двух независимых экспериментов. C) Значения инсулина в плазме на 12 + 5 неделе OGTT представлены как среднее значение ± SEM двух независимых экспериментов. D) Безжировая масса в граммах в течение периода диетического вмешательства как среднее значение ± стандартная ошибка среднего из двух независимых экспериментов. A-D) Статистическая значимость по сравнению с WD _CNTL с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA-RM, скорректированного с учетом множественных сравнений методом Dunnett post hoc. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Дополнительная цифра S4: A) Безжировая масса в граммах в течение периода диетического вмешательства как среднее значение ± SEM.Статистическая значимость по сравнению с WD _REF с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA-RM, скорректированного с учетом множественных сравнений по Даннету post hoc. B) Увеличение массы тела; в течение первых 21 недели мышей кормили либо LFD, либо WD _REF , как указано. Мышей, получавших WD _REF , впоследствии разделяли на экспериментальные группы, кормили указанными диетами в течение дополнительных 5 недель. C) Конечная масса тела 21 неделя + 5. D) Суммарное потребление энергии в ккал на мышь во время диетического вмешательства (от 21 + 0 до 21 + 5 недель). C-D) Статистически значимые отличия от WD _CNTL с помощью одностороннего дисперсионного анализа, скорректированного с учетом множественных сравнений с помощью апостериорного анализа Даннета. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Дополнительный рисунок S5: A) Анализ основных координат (PCoA) липидов печени, идентифицированных в режиме положительной ионизации. B) То же, что и в A, но изображено на графике вулкана со значительно регулируемыми видами липидов (FDR <0,05), представленными по шкале log2 либо зеленым (WD _McB > WD _Ref ), либо синим (WD _McB < WD _Ref ). C) Липидные пути, идентифицированные анализом кратности изменения, который отделяет группы LFD- (серый) и WD _McB (зеленый) от WD _Ref в режиме положительной ионизации. D) Соотношение Firmicutes / Bacteroidetes фекальных бактерий, отобранных до диетического вмешательства на 21 неделе + 0. Статистически значимые отличия от WD _Ref с помощью одностороннего дисперсионного анализа, скорректированного с учетом множественных сравнений с помощью апостериорного анализа Даннета. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Состав экспериментальных диет, использованных в исследованиях, в% вес.Экспериментальные диеты были основаны на подобранном по партии белке WDNo с последующим добавлением казеина, масла макадамии и цельноклеточного лизата McB, как указано.

Результаты анализа deseq бактериальных родов в двух экспериментах, представленных на рис. 1 и S1, с указанием названия рода, складчатого изменения и Log2-кратного изменения. сравнение WD _McB с WD _CNTL . Не скорректированные значения p, а также значения p, скорректированные методом Бенджамини-Хохберга, сообщаются и статистически значимо затронуты роды (с поправкойp <0,05) выделены жирным шрифтом.

Сообщенные p-значения по сравнению с WD _REF получены анализом смешанных эффектов с множественными сравнениями и post hoc Даннета.

Результаты анализа deseq бактериальных родов эксперимента 21 + 5 недель с указанием названия рода, Log2-кратное изменение, сравнение WD _McB с WD _REF . Не скорректированные значения p, а также значения p, скорректированные методом Бенджамини-Хохберга, сообщаются и статистически значимо затронуты роды (с поправкойp <0,05) выделены жирным шрифтом.

Сноски

• ↵14 Эти авторы совместно руководили этой работой

• Конфликты интересов BAHJ, JBH, ISL, KK, CRK и TEL являются соавторами Международной патентной заявки (PCT) № PCT / EP2018 / 071076 на основании прилагаемых данных.

• Финансирование Эта работа была поддержана Норвежским исследовательским советом (проект 267655). B.A.H.J. была поддержана Lundbeck Foundation (номер гранта: R232-2016-2425) и Novo Nordisk Foundation (номер гранта: NNF17OC0026698).A-L.G. и А. были поддержаны Канадскими институтами кардиологических исследований и Sentinel North из фонда Canada First Research Excellence Fund.

МЕТРОПОЛИТАН БАНК События – mcb

• Котировки Монитор
• Zacks Research
  • Идеи акционерного капитала
  • Идеи ETF
  • Идеи взаимного фонда
• График
  • Фундаментальная диаграмма
  • График производительности
  • Техническая карта
  • График трендов
• Скрининг
  • Старые скринеры Zacks
    • Скринер акций
    • Проверка ETF
    • Проверка паевых инвестиционных фондов
• Новости и события
  • Календарь событий
  • Экономический календарь
  • Новости
  • Сюрпризы активность

• Конструктор таблиц
  • Построитель таблицы капитала
  • Построитель таблиц ETF
  • Построитель таблиц взаимных фондов

• Служба поддержки
  • Руководства
  • Видеоуроки
  • Свяжитесь с нами
  • О нас

• Авторизоваться

Медицинский факультет Университета Вандербильта

Short SP, Pilat JM, Barrett CW, Reddy VK, Haberman Y, Hendren JR, Marsh BJ, Keating CE, Motley AK, Hill KE, Zemper AE, Washington MK, Shi C, Chen X, Wilson KT, Hyams JS, Denson Лос-Анджелес, Бурк РФ, Розен MJ, Уильямс CS .Селенопротеин Р, производный эпителием толстой кишки, является источником антиоксидантной защиты при раке, ассоциированном с колитом. Гастроэнтерология [распечатка-электроника] . 2021 апр; 160 (5): 1694-1708.e3. PMID: 33388316, PMCID: PMC8035252, PII: S0016-5085 (20) 35623-7, DOI: 10.1053 / j.gastro.2020.12.059, ISSN: 1528-0012.

Kilonzo VW, Sasuclark AR, Torres DJ, Coyle C, Pilat JM, Williams CS, , Pitts MW. Ювенильный дефицит селена ухудшает познавательную способность, сенсомоторную активацию и энергетический гомеостаз у мышей. Передняя гайка . 2021; 8: 667587. PMID: 34026810, PMCID: PMC8138326, DOI: 10.3389 / fnut.2021.667587, ISSN: 2296-861X.

Чокси Ю.А., Чапарро Дж., Бланко М., Шарда Р., Саркер С., Фергюсон С., Хиггинботэм Т., Хайремат Г., Реветта Ф., Вашингтон М.К., Уильямс К.С. , Ваези М.Ф. Импеданс и гистологические характеристики подгортанного пищевода позволяют отличить эозинофильный эзофагит от других заболеваний пищевода. Клин Гастроэнтерол Гепатол [распечатка-электроника] .2020 июл; 18 (8): 1727-1735.e2. PMID: 31589979, PMCID: PMC8019324, PII: S1542-3565 (19) 31081-X, DOI: 10.1016 / j.cgh.2019.09.032, ISSN: 1542-7714.

Hale AT, Brown RE, Luka Z, Hudson BH, Matta P, Williams CS , York JD. Модуляция метаболической токсичности ассимиляции серы преодолевает анемию и гемохроматоз у мышей. Adv Biol Regul [печатная версия] . 2020 Май; 76: 100694. PMID: 32019729, PMCID: PMC7230019, PII: S2212-4926 (20) 30005-1, DOI: 10.1016 / j.jbior.2020.100694, ISSN: 2212-4934.

Permar SR, Ward RA, Barrett KJ, Freel SA, Gbadegesin RA, Kontos CD, Hu PJ, Hartmann KE, Williams CS , Vyas JM. Обращение к трубопроводу врач-ученый: стратегии интеграции исследований в программы клинической подготовки. Дж. Клин Инвест . 2020 марта 02.03.2020; 130 (3): 1058-61. PMID: 32039914, PMCID: PMC7269558, PII: 136181, DOI: 10.1172 / JCI136181, ISSN: 1558-8238.

Short SP, Barrett CW, Stengel KR, Revetta FL, Choksi YA, Coburn LA, Lintel MK, McDonough EM, Washington MK, Wilson KT, Prokhortchouk E, Chen X, Hiebert SW, Reynolds AB, Williams CS .Kaiso необходим для MTG16-зависимого воздействия на карциному, ассоциированную с колитом. Онкоген [распечатка в электронном виде] . 2019 июн; 38 (25): 5091-106. PMID: 30858547, PMCID: PMC6586520, PII: 10.1038 / s41388-019-0777-7, DOI: 10.1038 / s41388-019-0777-7, ISSN: 1476-5594.

Short SP, Thompson JJ, Bilotta AJ, Chen X, Revetta FL, Washington MK, Williams CS . Серин треонинкиназа 17A поддерживает состояние эпителия в клетках рака прямой и прямой кишки. Mol Cancer Res [печатная версия] .2019 Apr; 17 (4): 882-94. PMID: 30655319, PMCID: PMC6941354, PII: 1541-7786.MCR-18-0990, DOI: 10.1158 / 1541-7786.MCR-18-0990, ISSN: 1557-3125.

Chen MS, Lo YH, Chen X, Williams CS , Donnelly JM, Criss ZK, Patel S, Butkus JM, Dubrulle J, Finegold MJ, Shroyer NF. Независимый от фактора роста 1 Является геном-супрессором опухоли при колоректальном раке. Mol Cancer Res [печатная версия] . 2019 Март; 17 (3): 697-708. PMID: 30606770, PMCID: PMC7387124, PII: 1541-7786.MCR-18-0666, DOI: 10.1158 / 1541-7786.MCR-18-0666, ISSN: 1557-3125.

Сковилл Э.А., Алламан М.М., Адамс Д.В., Мотли А.К., Пейтон С.К., Фергюсон С.Л., Хорст С.Н., Вильямс С.С. , Болье Д.Б., Шварц Д.А., Уилсон К.Т., Коберн Л.А. Полиненасыщенные жирные кислоты сыворотки коррелируют с сывороточными цитокинами и клинической активностью при болезни Крона. Научный сотрудник . 2019 27.02.2019; 9 (1): 2882. PMID: 30814550, PMCID: PMC6393448, PII: 10.1038 / s41598-019-39232-z, DOI: 10.1038 / s41598-019-39232-z, ISSN: 2045-2322.

Thompson JJ, Short SP, Parang B, Brown RE, Li C, Ng VH, Saito-Diaz K, Choksi YA, Washington MK, Smith JJ, Fingleton B, Brand T, Lee E, Coffey RJ, Williams CS . Вещество эпикарда кровеносных сосудов (BVES) снижает уровень рецептора LRP6 и цитоплазматического -катенина, чтобы модулировать передачу сигналов Wnt и гомеостаз кишечника. Канцерогенез [распечатка-электроника] . 2019 января 23.01.2019; PMID: 30689807, PMCID: PMC8067673, PII: 5299709, DOI: 10.1093 / carcin / bgz007, ISSN: 1460-2180.

Williams CS , Инесс А.Н., Барон Р.М., Аджихола О.А., Ху П.Дж., Вьяс Дж.М., Байоччи Р., Адами А.Дж., Левер Дж. Р., Заиди М. Подготовка врача-ученого: взгляды руководителей программ и начинающих молодых исследователей. JCI Insight . 2018.12.06.2018; 3 (23): PMID: 30518696, PMCID: PMC6328016, PII: 125651, DOI: 10.1172 / jci.insight.125651, ISSN: 2379-3708.

Коричневый RE, Короткий SP, Williams CS . Колоректальный рак и метаболизм. Curr Colorectal Cancer Rep [печатная версия] . 2018 Dec; 14 (6): 226-41. PMID: 31406492, PMCID: PMC66, DOI: 10.1007 / s11888-018-0420-y, ISSN: 1556-3790.

Short SP, Pilat JM, Williams CS . Роль селена и селенопротеина P в развитии, прогрессировании и профилактике кишечных заболеваний. Free Radic.Биол. Med [печатно-электронная] . 2018 01.11.2018; 127: 26-35. PMID: 29778465, PII: S0891-5849 (18) 30890-6, DOI: 10.1016 / j.freeradbiomed.2018.05.066, ISSN: 1873-4596.

Coburn LA, Singh K, Asim M, Barry DP, Allaman MM, Al-Greene NT, Hardbower DM, Polosukhina D, Williams CS , Delgado AG, Piazuelo MB, Washington MK, Gobert AP, Wilson KT. Потеря члена 2 семейства 7 переносчиков растворенных веществ усугубляет ассоциированный с воспалением туморогенез толстой кишки. Онкоген [распечатка в электронном виде] .2018.09.10.2018; PMID: 30202097, PII: 10.1038 / s41388-018-0492-9, DOI: 10.1038 / s41388-018-0492-9, ISSN: 1476-5594.

Choksi YA, Reddy VK, Singh K, Barrett CW, Short SP, Parang B, Keating CE, Thompson JJ, Verriere TG, Brown RE, Piazuelo MB, Bader DM, Washington MK, Mittal MK, Brand T, Gobert AP, Коберн Л.А., Уилсон К.Т., Уильямс CS . BVES требуется для поддержания целостности эпителия толстой кишки при экспериментальном колите путем изменения проницаемости кишечника. Mucosal Immunol [распечатка в электронном виде] . 2018 сен; 11 (5): 1363-74. PMID: 29

9, PMCID: PMC6162166, PII: 10.1038 / s41385-018-0043-2, DOI: 10.1038 / s41385-018-0043-2, ISSN: 1935-3456.

Brown JJ, Short SP, Stencel-Baerenwald J, Urbanek K, Pruijssers AJ, McAllister N, Ikizler M, Taylor G, Aravamudhan P, Khomandiak S, Jabri B, Williams CS , Dermody TS. Индуцированный реовирусом апоптоз в кишечнике. Установление кишечной инфекции. Дж.Вирол [электронная печать] . 2018 5/15/2018 мая; 92 (10): PMID: 29514905, PMCID: PMC58, PII: JVI.02062-17, DOI: 10.1128 / JVI.02062-17, ISSN: 1098-5514.

Blanchard M, Burton MC, Geraci MW, Madaio MP, Marsh JD, Proweller A, Rockey DC, Salata RA, Tan W, Williams CS , Zaidi M, Todd RF. Лучшие практики для программ обучения врачей-ученых: рекомендации Альянса академической внутренней медицины. Am. J. Med [печатная электроника] .2018 Май; 131 (5): 578-84. PMID: 29410155, PII: S0002-9343 (18) 30087-1, DOI: 10.1016 / j.amjmed.2018.01.015, ISSN: 1555-7162.

Сайто-Диас К., Беншабейн Х., Тивари А., Тиан А., Ли Б., Томпсон Дж. Дж., Хайд А.С., Сойер Л. М., Джодоин Дж. Н., Сантос Э, Ли Л. А., Коффи Р. Дж., Бошамп Р. Д., Уильямс К. С. , Кенуорти А. К. , Роббинс Д. Д., Ахмед Ю., Ли Э. APC ингибирует лиганд-независимую передачу сигналов Wnt по клатриновому эндоцитарному пути. Dev. Ячейка . 2018 марта 12.03.2018; 44 (5): 566-581.e8. PMID: 29533772, PMCID: PMC5884143, PII: S1534-5807 (18) 30108-4, DOI: 10.1016 / j.devcel.2018.02.013, ISSN: 1878-1551.

Томпсон Дж. Дж., Уильямс CS . Протеин-фосфатаза 2A в регуляции передачи сигналов Wnt, стволовых клеток и рака. Гены (Базель) . 2018.02.26.2018; 9 (3): PMID: 29495399, PMCID: PMC5867842, PII: genes^{21, DOI: 10.3390 / genes21, ISSN: 2073-4425.}

Сковилль Е.А., Алламан М.М., Браун К.Т., Мотли А.К., Хорст С.Н., Уильямс С.С. , Кояма Т., Чжао З., Адамс Д.В., Болье Д.Б., Шварц Д.А., Уилсон К.Т., Коберн Л.А.Изменения липидного, аминокислотного и энергетического метаболизма позволяют отличить болезнь Крона от язвенного колита и контрольных субъектов по метаболомическому профилю сыворотки. Метаболомика [печатно-электронная] . 2018 Янв; 14 (1): PMID: 29681789, PMCID: PMC5

3, DOI: 10.1007 / s11306-017-1311-y, ISSN: 1573-3882.

Parang B, Thompson JJ, Williams CS . Эпикардиальная субстанция кровеносных сосудов (BVES) в соединительной передаче сигналов и раке. Тканевые барьеры [распечатка-электроника] .2018; 6 (4): 1-12. PMID: 30307367, PMCID: PMC6389126, DOI: 10.1080 / 21688370.2018.1499843, ISSN: 2168-8370.

McDonough EM, Barrett CW, Parang B, Mittal MK, Smith JJ, Bradley AM, Choksi YA, Coburn LA, Short SP, Thompson JJ, Zhang B, Poindexter SV, Fischer MA, Chen X, Li J, Revetta FL, Наик Р., Вашингтон М.К., Розен М.Дж., Хиберт С.В., Уилсон К.Т., Уильямс CS . MTG16 является опухолевым супрессором при колит-ассоциированной карциноме. JCI Insight [электронная распечатка] .2017.08.2017; 17.08.2017; 2 (16): PMID: 28814670, PMCID: PMC5621889, PII: 78210, DOI: 10.1172 / jci.insight.78210, ISSN: 2379-3708.

Short SP, Costacurta PW, Williams CS . Использование трехмерных органоидных культур для моделирования физиологии кишечника и колоректального рака. Curr Colorectal Cancer Rep [печатная версия] . 2017 июн; 13 (3): 183-91. PMID: 269, PMCID: PMC5736147, DOI: 10.1007 / s11888-017-0363-8, ISSN: 1556-3790.

Parang B, Kaz AM, Barrett CW, Short SP, Ning W, Keating CE, Mittal MK, Naik RD, Washington MK, Revetta FL, Smith JJ, Chen X, Wilson KT, Brand T, Bader DM, Tansey WP, Чен Р., Брентналл Т.А., Грейди В.М., Уильямс CS .BVES регулирует стабильность c-Myc через PP2A и подавляет индуцированный колитом опухолеобразование. Gut [распечатка-электроника] . 2017 Май; 66 (5): 852-62. PMID: 28389570, PMCID: PMC5385850, PII: gutjnl-2015-310255, DOI: 10.1136 / gutjnl-2015-310255, ISSN: 1468-3288.

Wang C, Gong G, Sheh A, Muthupalani S, Bryant EM, Puglisi DA, Holcombe H, Conaway EA, Parry NA, Bakthavatchalu V, Short SP, Williams CS , Wogan GN, Tannenbaum SR, Fox JG, Horwitz BH. Интерлейкин-22 управляет зависимым от оксида азота повреждением ДНК и дисплазией на мышиной модели рака, ассоциированного с колитом. Mucosal Immunol [распечатка в электронном виде] . 2017 2/15/2017; PMID: 28198364, PII: mi20179, DOI: 10.1038 / mi.2017.9, ISSN: 1935-3456.

Short SP, Williams CS . Селенопротеины в онкогенезе и прогрессировании рака. Adv. Cancer Res . 2017; 136: 49-83. PMID: 2

22, PMCID: PMC5819884, PII: S0065-230X (17) 30038-6, DOI: 10.1016 / bs.acr.2017.08.002, ISSN: 2162-5557.

Barrett CW, шорт SP, Williams CS .Селенопротеины и вызванный окислительным стрессом воспалительный онкогенез в кишечнике. Ячейка. Мол. Life Sci [распечатка-электроника] . 2016, 25 августа 2016 г .; PMID: 27563706, PII: 10.1007 / s00018-016-2339-2, DOI: 10.1007 / s00018-016-2339-2, ISSN: 1420-9071.

Barrett CW, Short SP, Choksi YA, Williams CS . Окрашивание пролиферации энтероидов целиком. Био Протокол . 2016, 20.06.2016; 6 (12): PMID: 29333475, PMCID: PMC5760989, DOI: 10.21769 / BioProtoc.1837 г., ISSN: 2331-8325.

Parang B, Bradley AM, Mittal MK, Short SP, Thompson JJ, Barrett CW, Naik RD, Bilotta AJ, Washington MK, Revetta FL, Smith JJ, Chen X, Wilson KT, Hiebert SW, Williams CS . Гены миелоидной транслокации по-разному регулируют программы колоректального рака. Онкоген [распечатка в электронном виде] . 2016.06.06.2016; PMID: 27270437, PII: onc2016167, DOI: 10.1038 / onc.2016.167, ISSN: 1476-5594.