Колит мкб 10: Ошибка 404. Файл не найден

Содержание

МКБ-10 код K52 | Другие неинфекционные гастроэнтериты и колиты

ICD-10

ICD-10 is the 10th revision of the International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems (ICD), a medical classification list by the World Health Organization (WHO).

It contains codes for diseases, signs and symptoms, abnormal findings, complaints, social circumstances, and external causes of injury or diseases.

ATC

The Anatomical Therapeutic Chemical (ATC) Classification System is used for the classification of active ingredients of drugs according to the organ or system on which they act and their therapeutic, pharmacological and chemical properties.

It is controlled by the World Health Organization Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology (WHOCC).

DDD

The defined daily dose (DDD) is a statistical measure of drug consumption, defined by the World Health Organization (WHO).

It is used to standardize the comparison of drug usage between different drugs or between different health care environments.

Неспецифический язвенный колит. Болезнь Крона > Архив – Клинические протоколы МЗ РК

 

Цели лечения: поддержание ремиссии и профилактика осложнений (исчезновение патологических примесей в кале, нормализация стула, купирование болей в животе, регрессия системных проявлений, снижение СОЭ, увеличение содержания гемоглобина и т. д.).


Немедикаментозное лечение: диета № 4.
 

Медикаментозное лечение

Рекомендуется вареная и приготовленная на пару протертая пища с повышенным содержанием белка, ограничением клетчатки, жира и индивидуально непереносимых продуктов (как правило, молока).


При тяжелом течении заболевания 

при потере свыше 15% массы тела за период данного обострения показано парентеральное питание. При этом необходима адекватная гидратация и коррекция электролитных нарушений (чаще гипокалиемии).


В лечении НЯК и БК доказана эффективность 5-аминосалициловой кислоты (5-АСК), глюкокортикоидов и цитостатиков. Базисная терапия заключается в назначении препаратов 5-АСК (желательно в сочетании с фолиевой кислотой).

Основными показаниями для назначения кортикостероидов при НЯК являются: левосторонние и тотальные поражения с тяжелым течением, III степень активности, острые тяжелые и среднетяжелые формы с внекишечными проявлениями/осложнениями.

Показаниями для назначения кортикостероидов при БК являются: анемия тяжелой степени, потеря массы тела свыше 20% исходной, внекишечные проявления/осложнения, рецидив после операции.

У пациентов с непереносимостью или неэффективностью 5-АСК и кортикостероидов, показаны цитостатики (азатиоприн), которые также назначают пациентам, у которых ремиссия достигнута их применением.


При легком течении используют месалазин в дозе 2-4 г/сутки преимущественно в таблетированной форме или сульфасалазин (2-8 г/сутки). Предпочтение отдается месалазину, менее токсичному и оказывающему меньшие побочные эффекты. При изолированном проктите возможно назначение месалазина в форме ректальных суппозиториев и клизм (4-8 г/сутки).
Для более стойкого эффекта возможна комбинация препаратов 5-АСК с кортикостероидами, назначаемыми в виде ректальных клизм (гидрокортизон в дозе 125 мг, преднизолон 20 мг дважды в сутки до прекращения кровянистых выделений). По достижении ремиссии пациенты должны получать в течение как минимум 2 лет поддерживающую терапию месалазином или сульфасалазином (2 г/сутки).

При среднетяжелых формах препараты 5-АСК в вышеуказанных дозах комбинируют с кортикостероидами (гидрокортизон или преднизолон). Гидрокортизон вводят ректально в дозе 100-200 мг дважды в сутки. Преднизолон назначают также в виде клизм по 20 мг дважды в сутки либо внутрь 40 мг в сутки (до достижения эффекта, как правило, в течение первой недели), 30 мг (следующая неделя), 20 мг (один месяц) с последующим снижением дозы на 5 мг/сутки. При наличии перианальных осложнений в комплекс лечебных мероприятий включают метронидазол в дозе 1,0-1,5 г/сутки. Дополнительные препараты (антибиотики, пребиотики, ферменты и др.) назначают по показаниям.

 

При тяжелых формах препараты 5-АСК в вышеуказанных дозах комбинируют с большими дозами кортикостероидов. Гидрокортизон назначают по 100 мг внутривенно 6 раз в сутки или преднизолон 30 мг внутривенно 4 раза в сутки, в течение 5-7 дней. Внутривенное введение кортикостероидов сочетают с ректальным (гидрокортизон по 100 мг в клизмах 2 раза в сутки).

В дальнейшем переходят на пероральное назначение кортикостероидов. По показаниям, указанным выше, азатиоприн назначают внутривенно в дозе 150 мг/сутки. В дальнейшем в качестве поддерживающей терапии азатиоприн назначают в дозе 50 мг/сутки.

Осмотр пациентов необходимо производить ежедневно, а находящихся в тяжелом состоянии – 2 раза в сутки. Особое внимание следует обращать на изменения температуры тела, частоты пульса, размеров живота и напряжения брюшной стенки.


Экстренными показаниями к оперативному лечению НЯК (колэктомии) являются: токсическая дилатация, перфорация, массивное кровотечение, отсутствие улучшения при тяжелом течении на фоне адекватной терапии (включая внутривенное введение стероидов) в течение 5 суток. Плановые показания включают: тяжелое течение НЯК при отсутствии эффекта от консервативной терапии с прогрессированием заболевания, частыми рецидивами, значительно ухудшающими качество жизни, дисплазия высокой степени или озлокачествление.


Основными показаниями к оперативному лечению БК являются: тяжелые формы при отсутствии эффекта от консервативной терапии, кишечная непроходимость вследствие стриктур, свищи, абсцессы, перфорация.


Профилактические мероприятия
На амбулаторном этапе проводят лечение обострений НЯК и БК с легким течением заболевания, а также поддерживающую и противорецидивную терапию у больных, выписанных из стационара.


Дальнейшее ведение: динамическое наблюдение по достижении ремиссии заключается в проведении эндоскопического исследования не реже одного раза в 2 года на протяжении как минимум 8 лет.

Перечень основных медикаментов:

1. *Месалазин 250 мг, 500 мг табл., суппозитории, клизмы (4 г)

2. *Сульфасалазин 500 мг, табл.

3. *Гидрокортизон, *Преднизолон, табл., амп., фл.

1. *Метронидазол 250 мг, 500 мг, табл, фл.


Перечень дополнительных медикаментов:

1. *Азатиоприн 50 мг, табл.


Индикаторы эффективности лечения: исчезновение патологических примесей в кале, купирование болей в животе, нормализация стула, регрессия системных проявлений.

* – препарат, входящий в список жизненно-важных лекарственных средств

Хронический колит – код по МКБ 10

Одной из наиболее распространенных патологий дистальных отделов кишечника считается хронический колит. Для проведения статистических исследований и учета заболеваемости хронический колит по МКБ имеет код К52.

Гастроэнтерологи и проктологи часто используют код этого заболевания при оформлении различной медицинской документации. Хронический колит характеризуется воспалительным поражением толстой кишки, которое в некоторых случаях носит язвенный характер и сопровождается деструкцией слизистой оболочки. Для постановки правильного диагноза необходимо знать классификацию и основные этиологические факторы, которые вызывают данное патологическое состояние.

Хронический колит в МКБ 10

В международной классификации болезней 10-го пересмотра нозологические единицы сортируют в зависимости от клинических проявлений, патогенеза и этиологии. Код колита в МКБ 10 – К52, однако в зависимости от формы болезни, шифр варьирует от К52.0 до К52.9. Неспецифический язвенный колит и болезнь Крона выделены, как отдельные заболевания, так как они имеют аутоиммунную природу.

Основными причинами, провоцирующими развитие воспалительных поражений толстого кишечника, являются:

  • инфекционные и паразитарные болезни;
  • лучевые поражения;
  • отравления токсическими веществами;
  • аутоиммунные реакции;
  • нарушения нервной регуляции ЖКТ.

Хроническое воспаление толстой кишки в зависимости от фактора, который его вызывает, может быть инфекционным и неинфекционным. Также нередко заболевание сочетается с гастроэнтеритом и другими патологиями пищеварительной системы.

Особенности течения болезни

У больных превалируют жалобы на болевые ощущения в области живота и нарушения стула.

В зависимости от формы патологического процесса в каловых массах может обнаруживаться кровь и слизь в разных пропорциях.

Нередко пациенты страдают запорами или наоборот – диареей. В МКБ 10 хронический колит относится к разделу болезней пищеварительного тракта, поэтому диагностикой патологии должен заниматься гастроэнтеролог или проктолог. Ранняя диагностика позволяет существенно повысить шансы успешного излечения, при условии, что пациент будет придерживаться специальной диеты и следовать рекомендациям доктора. При несвоевременном обращении к специалисту могут возникнуть серьезные осложнения в виде кровотечения, интоксикации или развития злокачественной опухоли.

Сохраните ссылку, или поделитесь полезной информацией в соц. сетях

Оцените статью

Загрузка…

сигмоидит хронический – это… Что такое сигмоидит хронический?

сигмоидит хронический
(s. chronica) С., характеризующийся постепенным началом, болью в левой половине живота, длительным течением с чередованием ремиссий и обострений.

Большой медицинский словарь. 2000.

  • сигмоидит слизистый
  • сигмоидит язвенный

Смотреть что такое “сигмоидит хронический” в других словарях:

  • СИГМОИДИТ — (sigmoiditis), заболевание, объединяющее ряд пат. процессов воспалительного происхождения в S образной кишке. В одних случаях эти процессы являются лишь частичным выражением воспаления всей толстой кишки колита, в других сегментарной его формой,… …   Большая медицинская энциклопедия

  • МКБ-10: Класс XI —   Международная классификация болезней 10 го пересмотра (МКБ 10) Класс I Некоторые инфекционные и паразитарные болезни Класс II Новообразования Класс III Болезни крови, кроветворных органов и отдельные нарушен …   Википедия

  • МКБ-10: Класс K — Международная классификация болезней 10 го пересмотра (МКБ 10) Класс I Некоторые инфекционные и паразитарные болезни Класс II Новообразования Класс III Болезни крови, кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм Класс …   Википедия

  • МКБ-10: Код K — Международная классификация болезней 10 го пересмотра (МКБ 10) Класс I Некоторые инфекционные и паразитарные болезни Класс II Новообразования Класс III Болезни крови, кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм Класс …   Википедия

  • Колит — I Колит (colitis; греч. kolon толстая кишка + itis) воспалительное или воспалительно дистрофическое поражение толстой кишки. Процесс может локализоваться во всех отделах толстой кишки (панколит) или отдельных ее частях (сегментарный колит). При… …   Медицинская энциклопедия

  • Колит — МКБ 10 K50. 50. K52 МКБ 9 558558 OMIM 191390 …   Википедия

  • Язвенный колит — Неспецифический язвенный колит МКБ 10 K …   Википедия

Перечень заболеваний, наличие которых дает право на обучение по основным общеобразовательным программам на дому

N п/п

Код по МКБ 10 <1>

Нозологические единицы

Особенности течения заболевания, требующие обучения на дому (форма, стадия, фаза, степень тяжести заболевания, течение заболевания, осложнения, терапия)

 

Новообразования

1.

C00 – C97

Злокачественные новообразования

В условиях длительного применения иммуносупресивной терапии (более 1 месяца) при наличии побочных действий и (или) нежелательных реакций, связанных с применением лекарственного препарата; состояние после трансплантации

 

Болезни крови, кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм

2.

D60 – D61

Апластические анемии

В условиях длительного применения иммуносупресивной терапии (более 1 месяца) при наличии побочных действий и (или) нежелательных реакций, связанных с применением лекарственного препарата; состояние после трансплантации костного мозга

3.

D66 – D67

Нарушение свертываемости крови

Тяжелой степени

4.

D69

Пурпура и другие геморрагические состояния

Тяжелой степени и (или) в условиях длительного применения иммуносупресивной терапии (более 1

5.

D89

Отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм

месяца) при наличии побочных действий и нежелательных реакций, связанных с применением лекарственного препарата

 

Болезни эндокринной системы

6.

E10

Сахарный диабет I типа

Тяжелой степени

 

Психические расстройства и расстройства поведения

7.

F06.6

Органическое эмоционально лабильное (астеническое) расстройство

Со стойкими значительными неконтролируемыми нарушениями поведения, но не представляющими опасность для себя и (или) окружающих, на фоне фармакорезистентности или длительного подбора терапии (более 1 месяца)

8.

F07

Расстройства личности и поведения вследствие болезни повреждения и дисфункции головного мозга

9.

F20 – F29

Шизофрения, шизотипические и бредовые расстройства

10.

F30 – F39

Расстройства настроения (аффективные расстройства)

11.

F70 – F79

Умственная отсталость

12.

F84

Общие расстройства психологического развития

Тяжелой степени, со стойкими значительными неконтролируемыми нарушениями поведения, но не представляющими опасность для себя и (или) окружающих, на фоне фармакорезистентности или длительного подбора терапии (более 1 месяца)

13.

F90.1

Гиперкинетическое расстройство поведения

14.

F95.2

Комбинирование вокализмов и множественных моторных тиков (синдром де ла Туретта)

15.

F98.1

Энкопрез неорганической природы

Тяжелой степени, исключается каломазание

16.

F98.8

Другие уточненные эмоциональные расстройства и расстройства поведения с началом, обычно приходящимся на детский возраст

Тяжелой степени, со стойкими значительными неконтролируемыми нарушениями поведения, но не представляющими опасность для себя и (или) окружающих, на фоне фармакорезистентности или длительного подбора терапии (более 1 месяца)

 

Болезни нервной системы

17.

G12

Спинальная мышечная атрофия и родственные синдромы

Тяжелые двигательные нарушения, затрудняющие нахождение и (или) передвижение на инвалидной коляске

18.

G24.1

Идиопатическая семейная дистония

Тяжелой степени, на фоне фармакорезистентности или подбора терапии (более 1 месяца)

19.

G24.2

Идиопатическая несемейная дистония

20.

G25.3

Миоклонус

21.

G25.4

Хорея, вызванная лекарственным средством

22.

G25.5

Другие виды хореи

23.

G25.8

Другие уточненные экстрапирамидные и двигательные нарушения

24.

G31.8

Другие уточненные дегенеративные болезни нервной системы

В условиях длительного применения иммуносупресивной терапии (более 1 месяца) при наличии побочных действий и (или) нежелательных реакций, связанных с применением лекарственного препарата; тяжелые двигательные нарушения, затрудняющие нахождение и/или передвижение на инвалидной коляске

25.

G35 – G37

Демиелинизирующие болезни центральной нервной системы

26.

G40

Эпилепсия

Эпилепсия, сопровождающаяся частыми (более 4 раз в месяц) дневными генерализованными вторичногенерализованными и (или) приступами, в том числе с риском развития эпилептического статуса, на фоне фармакорезистентности или длительного подбора противосудорожной терапии (более 1 месяца)

27.

G43

Мигрень

Тяжелая форма мигрени (долговременные приступы с выраженными сопутствующими проявлениями, перерывы между приступами – несколько дней)

28.

G71.0

Мышечная дистрофия

Тяжелые двигательные нарушения, затрудняющие нахождение и (или) передвижение на инвалидной коляске

29.

G71.2

Врожденные миопатии

30.

G71.3

Митохондриальная миопатия, не классифицированная в других рубриках

31.

G71.8

Другие первичные поражения мышц

32.

G72.8

Другие уточненные миопатии

33.

G80

Детский церебральный паралич

34.

G82

Параплегия и тетраплегия

 

Болезни глаза и его придаточного аппарата

35.

h26

Кератит

Часто рецидивирующий, вялотекущий и (или) в условиях длительного применения иммуносупресивной терапии (более 1 месяца) при наличии побочных действий и (или) нежелательных реакций, связанных с применением лекарственного препарата

36.

h30.1

Хронический иридоциклит

37.

h40

Хориоретинальное воспаление

38.

h56

Неврит зрительного нерва

39.

h43

Отслойка и разрывы сетчатки

В течение 1 года после хирургического лечения

40.

h50.3 – h50.6

Глаукомы

Терминальная стадия

Q15.0

Врожденная глаукома

Болезни системы кровообращения

41.

I50

Сердечная недостаточность

Стадии II, III

 

Болезни органов дыхания

42.

J43

Эмфизема

Тяжелой степени; состояние после трансплантации легкого

43.

J44

Другая хроническая обструктивная легочная болезнь

44.

J96.1

Хроническая респираторная недостаточность

II, III степени тяжести

 

Болезни органов пищеварения

45.

K50 – K52

Неинфекционный энтерит и колит

Тяжелой степени с частым рецидивирующим течением

46.

K72.1

Хроническая печеночная недостаточность

Тяжелой степени

47.

K74

Фиброз и цирроз печени

Состояние после трансплантации печени

 

Болезни кожи

48.

L10 – L14

Буллезные нарушения

Тяжелой степени

49.

L20 – L30

Дерматит и экзема

Тяжелой степени и (или) в условиях длительного применения иммуносупресивной терапии (более 1 месяца) при наличии побочных действий и (или) нежелательных реакций, связанных с применением лекарственного препарата

Болезни костно-мышечной системы и соединительной ткани

50.

M05 – M14

Воспалительные полиартропатии

Тяжелой степени и (или) в условиях длительного применения иммуносупресивной терапии (более 1 месяца) при наличии побочных действий и нежелательных реакций, связанных с применением лекарственного препарата

51.

M24

Другие поражения суставов

Состояния после хирургического лечения на суставах, требующие длительной (более 1 месяца) иммобилизации в гипсовой повязке таза и (или) нижних конечностей

52.

M30 – M36

Системные поражения соединительной ткани

В условиях длительного применения иммуносупресивной терапии (более 1 месяца) при наличии побочных действий и (или) нежелательных реакций, связанных с применением лекарственного препарата

53.

M91.1

Юношеский остеохондроз головки бедренной кости (Легга-Калве-Пертеса)

После хирургического лечения и требующий иммобилизации в гипсовой повязке (более 1 месяца), затрудняющей нахождение и (или) передвижение на инвалидной коляске

 

Болезни мочеполовой сферы

54.

N01 – N08

Гломерулярные болезни

Тяжелой степени и (или) в условиях длительного применения иммуносупресивной терапии (более 1 месяца) при наличии побочных действий и нежелательных реакций, связанных с применением лекарственного препарата; состояние после трансплантации почки

55.

N10 – N16

Тубуло-интерстициальные болезни почек

Тяжелой степени, осложненное течение; состояние после трансплантации почки

56.

N18

Хроническая почечная недостаточность

Тяжелой степени

 

Последствия травм

57.

T90

Последствия травм головы

Осложненные наличием дефекта костей свода черепа, требующего хирургического лечения (пластика костей свода черепа), или осложненные носительством трахеостомической канюли

58.

T91

Последствия травм шеи и туловища

Требующие длительной иммобилизации в гипсовой повязке (более 1 месяца), затрудняющей нахождение и (или) передвижение на инвалидной коляске

59.

T93

Последствия травм нижней конечности

60.

T94.0

Последствия травм, захватывающих несколько областей тела

ФГБУ Детский санаторий “Белокуриха” им. В.В.Петраковой Министерства здравохранения Российской Федерации

Класс болезней по МКБ-10

Код заболевания по МКБ-10

Наименование заболевания

Болезни эндокринной системы, расстройства питания и нарушения обмена веществ (класс IV по МКБ-10)

Е66

Ожирение

Е66.0

Ожирение, обусловленное избыточным поступлением энергетических ресурсов

Болезни системы кровообращения (класс IX по МКБ-10)

I10

Эссенциальная (первичная) гипертензия

I34

Неревматические поражения митрального клапана

I34.0

Митральная (клапанная) недостаточность (не более I степени)

I34.8

Другие неревматические поражения митрального клапана

I35

Неревматические поражения аортального клапана

I35.1

Аортальная (клапанная) недостаточность (не более I степени)

I35.8

Другие поражения аортального клапана

Болезни органов дыхания (класс X по МКБ-10)

J12

Вирусная пневмония, не классифицированная в других рубриках

J13

Пневмония, вызванная Streptococcus pneumoniae

J14

Пневмония, вызванная Haemophilus influenza [палочкой Афанасьева-Пфейффера]

J15

Бактериальная пневмония, не классифицированная в других рубриках

J15.0

Пневмония, вызванная Klebsiella pneumonia

J15.2

Пневмония, вызванная стафилококком

J15.3

Пневмония, вызванная стрептококком группы В

J15.4

Пневмония, вызванная другими стрептококками

J15.5

Пневмония, вызванная Escherichia coli

J15.6

Пневмония, вызванная другими аэробными грамотрицательными бактериями

J15.7

Пневмония, вызванная Mycoplasma pneumonia

J15.8

Другие бактериальные пневмонии

J17

Пневмония при болезнях, классифицированных в других рубриках

J17.0

Пневмония при бактериальных болезнях, классифицированных в других рубриках

J17.2

Пневмония при микозах

J17.3

Пневмония при паразитарных болезнях

J41

Простой и слизисто-гнойный хронический бронхит

J43

Эмфизема

J43.0

Синдром Мак-Леода

J44

Другая хроническая обструктивная легочная болезнь

J44.8

Другая уточненная хроническая обструктивная легочная болезнь

Болезни органов пищеварения (класс XI по МКБ-10)

К20

Эзофагит

К21

Гастроэзофагеальный рефлюкс

К21.0

Гастроэзофагеальный рефлюкс с эзофагитом

К21.9

Гастроэзофагеальный рефлюкс без эзофагита

К22

Другие болезни пищевода

К22.0

Ахалазия кардиальной части

К22.1

Язва пищевода

К25

Язва желудка

К26

Язва двенадцатиперстной кишки

К29

Гастрит и дуоденит

К29.8

Дуоденит

К52

Другие неинфекционные гастроэнтериты и колиты

К52.2

Аллергический и алиментарный гастроэнтерит и колит

К58

Синдром раздраженного кишечника

К58.9

Синдром раздраженного кишечника без диареи

К59

Другие функциональные кишечные нарушения

К59.0

Запор

К80

Желчнокаменная болезнь [холелитиаз]

К80.1

Камни желчного пузыря с другим холециститом

К80.2

Камни желчного пузыря без холецистита

К80.5

Камни желчного протока без холангита или холецистита

К81

Холецистит

К81.1

Хронический холецистит

К82

Другие болезни желчного пузыря

К82.8

Другие уточненные болезни желчного пузыря

К90

Нарушения всасывания в кишечнике

К90.0

Целиакия

К91.5

Постхолецистэктомический синдром

Болезни мочеполовой системы (класс XIV по МКБ-10)

N70

Сальпингит и оофорит

N70.1

Хронический сальпингит и оофорит

N71

Воспалительные болезни матки, кроме шейки матки

N71.1

Хронические воспалительные болезни матки

N76

Другие воспалительные болезни влагалища и вульвы

N76.1

Подострый и хронический вагинит

N91

Отсутствие менструаций, скудные или редкие менструации

N94

Болевые и другие состояния, связанные с женскими половыми органами и менструальным циклом

N94.0

Боли в середине менструального цикла

N94.3

Синдром предменструального напряжения

N94.4

Первичная дисменорея

N94.5

Вторичная дисменорея

Публикации в СМИ

Псевдомембранозный колит — острое, тяжёлое заболевание толстой кишки, развивающееся как осложнение антибактериальной терапии. Частота • В общей популяции — 6,7:100 000 лечившихся антибиотиками • У 10–20% стационарных больных обнаруживают Clostridium difficile • Преобладающий возраст — 40–75 лет.

Этиология Clostridium difficile Уровень носительства среди взрослого населения составляет 2-3%.• Условия размножения Clostridium difficile — анаэробная среда и угнетение роста нормальной кишечной микрофлоры. Заболевание развивается при резистентности Clostridium difficile к антибиотикам, подавляющим жизнедеятельность прочей кишечной микрофлоры. Отсутствие конкуренции способствует ускоренному размножению Clostridium difficile и выделению токсинов • Наиболее часто колит вызывают клиндамицин, линкомицин, ампициллин, пенициллин, цефалоспорины, тетрациклин, эритромицин. Способ применения антибиотика не имеет значения. При приёме внутрь (кроме влияния на микрофлору) происходит местное воздействие антибиотика непосредственно на кишечную стенку.

Факторы риска • Длительное применение антибиотиков • Химиотерапия — фторурацил, метотрексат, комбинированные препараты • Хирургические вмешательства на кишечнике • Уремия • Ишемия кишечника • Трансплантация костного мозга.

Клиническая картина • Симптомы развиваются обычно от 3 дней до 4 недель от начала антибактериальной терапии • Водянистая диарея с неприятным запахом; редко — с примесью крови (в случае развития эрозивно-геморрагических изменений слизистой оболочки кишки). Частота стула может нарастать даже после прекращения приёма этиологически значимого антибиотика. Схваткообразные боли в нижних отделах живота, преимущественно в проекции толстого кишечника, после дефекации • Лихорадка (с повышением температуры тела до 38 °С). Дегидратация и электролитные расстройства — признак тяжёлого течения заболевания. Токсический мегаколон и перфорация толстой кишки — редкие, но серьёзные осложнения, требующие хирургического вмешательства.

Диагностика

• Анализ периферической крови •• Лейкоцитоз, сдвиг лейкоцитарной формулы влево •• Гипоальбуминемия.

• Подтверждение наличия Clostridium difficile •• Бактериологическое исследование каловых масс с определением в нем токсина Clostridium difficile — пробу на токсин считают положительной, если при исследовании на культуре ткани идентифицируют цитопатический токсин, нейтрализуемый специфическим антитоксином; частота положительного результата — 20–90% в зависимости от степени тяжести. Диагностика дисбиоза кишечника — газовая хроматография и масс-спектрометрия — выявляют существенные изменения состава нормальной микрофлоры в сторону увеличения концентрации различных микроорганизмов; общая колонизация слизистой оболочки увеличивается в 2-5 раз по сравнению с нормой.

• Колоноскопия — наличие жёлто-белых бляшковидных «мембран» из фибрина, лейкоцитов и отторгнутых некротизированных эпителиальных клеток, мягких, но плотно спаянных со слизистой оболочкой. Изменения наиболее выражены в дистальных отделах ободочной и прямой кишки •• Характерный признак — сохранение участков слизистой оболочки под псевдомембранозными наложениями, в виде мостиков перекидывающихся между пораженными участками Слизистая оболочка отечна, но не изъязвлена. При попытке снять псевдомембрану может возникнуть кровотечение. Гистологическое исследование может иметь диагностическое значение. Хотя по его результатам не всегда можно отличить картину псевдомембранозного колита от язвенного или ишемического.

• Обзорная рентгенография органов брюшной полости: вздутие толстой кишки • Ирригография •• Зубчатость контуров толстой кишки, связанная с изъязвлением слизистой оболочки или наличием псевдомембран, между выпуклыми поверхностями которых затекает бариевая взвесь •• Отёк стенки кишки, расширение складок, нарушение гаустрации.

Дифференциальная диагностика • Неспецифический язвенный колит • Болезнь Крона • Ишемический колит • Синдром раздражённой толстой кишки • Колиты инфекционной этиологии.

Тактика ведения • Отмена антибиотиков, обусловивших заболевание, за исключением случаев их назначения по жизненным показаниям • Этиотропная терапия, направленная на элиминацию Clostridium difficile. Ванкомицин по 125 мг 4 р/сут внутрь в течение 7–10 дней, при необходимости доза может быть увеличена до 500 мг 4 р/сут. Метронидазол 500 мг 2 р/сут внутрь или в/в в течение 7–10 дней • Коррекция метаболических нарушений и водно-электролитного баланса.

Бактериальная терапия — использование высоких доз пробиотиков (бифиформ, бифидобактерии бифидум и др.) или бактериальных смесей, имеющих сходство с человеческой фекальной флорой; возможно введение препаратов с помощью клизм на основе солевых р-ров, через назодуоденальный зонд или через колоноскоп. Эффект обусловлен бактерицидным действием фекальной флоры, что ведет к устранению симптомов заболевания более чем у 95% больных с диареей, ассоциированной с Clostridium difficile.

Хирургическое лечение. В случае развития тяжёлых осложнений (перфорация или острая токсическая дилатация толстой кишки) необходима тотальная колонэктомия или разгрузочная илеостома.

Осложнения • Токсическая дилатация толстой кишки • Перфорация толстой кишки • Тяжёлый синдром мальабсорбции.

Течение. Течение благоприятное в случае своевременного распознавания заболевания, отмены антибиотика, вызвавшего диарею, и адекватного лечения.

Синонимы • Псевдомембранозный энтероколит • Колика слизистая • Колика кишечная слизистая • Колика слизистая псевдомембранозная • Колит перепончатый • Колит слизисто-перепончатый • Колит слизистый

МКБ-10 • A04.7 Энтероколит, вызванный Clostridium difficile.

границ | Динамика активации моноцитов и макрофагов толстой кишки при колите

Введение

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) подвергается наибольшей антигенной нагрузке в организме, что представляет собой серьезную проблему для многих резидентных иммунных клеток (1). Макрофаги составляют самый крупный компонент системы мононуклеарных фагоцитов кишечника и играют ключевую роль в обеспечении иммунного гомеостаза (2). ВЗК, включая язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), характеризуются нарушенным иммунологическим гомеостазом у генетически предрасположенных лиц, хотя точная этиология неизвестна (3–5).

Недавно было показано, что кишечные макрофаги мышей постоянно переселяются из циркулирующих моноцитов крови, что определяется экспрессией маркеров клеточной поверхности Ly6C, CCR2 и CD62L (6). Однако функции зрелых кишечных макрофагов и рекрутированных моноцитов разительно различаются. Кишечные макрофаги обладают «толерантным» фенотипом, плохо реагируют на лиганды толлингового рецептора (TLR) (жизненно важны для предотвращения запуска воспалительных реакций при уничтожении комменсальных бактерий), в то же время поддерживая гомеостатическую среду посредством продукции IL-10 и PGE 2 (7).Напротив, моноциты толстой кишки мышей обладают провоспалительным действием, но редко в стабильном состоянии, увеличиваясь во время воспаления (2, 8–10).

Предыдущие исследования показали накопление человеческих клеток CD14 Hi или CD14 + HLA-DR Int в собственной пластинке желудочно-кишечного тракта (LP) во время воспаления (2, 6, 11–14). Результаты исследований на мышах (2) в сочетании с наблюдением за меченными радиоактивными изотопами моноцитами крови в воспаленной слизистой оболочке кишечника пациентов с ВЗК (15) указывают на то, что повышенные воспалительные мононуклеары LP являются результатом рекрутирования моноцитов, а не увеличения популяции резидентных макрофагов в тканях .Следовательно, поскольку моноциты и макрофаги считаются потенциальными клеточными мишенями для терапии, ограничивающей повреждающие реакции хозяина при кишечных заболеваниях (16), существует острая необходимость в улучшении разрешения этих событий в ткани слизистой оболочки.

Поверхностный фенотип иммунных клеток зависит от их расположения в желудочно-кишечном тракте, что имеет решающее значение при интерпретации предыдущих исследований. Например, макрофаги тонкой и толстой кишки демонстрируют высокую экспрессию MHC-II, CD163 и (у мышей) CX3CR1, тогда как макрофаги толстой кишки экспрессируют более высокие уровни кислой фосфатазы, CD40, CCR5 и рецептора формилпептида (17-19).Аналогичным образом недавнее плодотворное исследование генотипа-фенотипа при ВЗК выявило, как локализация заболевания в желудочно-кишечном тракте сильно коррелирует с генетической предрасположенностью (20). Таким образом, механизмы, лежащие в основе воспаления кишечника, вероятно, будут варьироваться в зависимости от расположения желудочно-кишечного тракта, например, тонкий кишечник или толстый кишечник. Данные о людях до сих пор были в значительной степени ограничены комбинированными хирургическими резекциями толстой и тонкой кишки у пациентов с ВЗК или здоровых пациентов, перенесших резекцию по другому показанию (например, формирование уростомы) (2, 12, 14, 21, 22).Таким образом, неясно, какие аспекты иммунного ответа толстой кишки вносят вклад в воспалительный фенотип, о котором ранее сообщалось для ВЗК.

Мы использовали прицельную биопсию толстой кишки человека для оценки баланса моноцитов: макрофагов во время воспаления толстой кишки у пациентов с ВЗК по сравнению со здоровыми людьми в контрольной группе, наряду с дополнительной работой с использованием мышиной модели колита DSS. Комбинация многопараметрической проточной цитометрии, кПЦР и микрочипов мРНК использовалась для определения нарушения баланса покоящихся моноцитов: макрофагов с притоком CD14 + HLA-DR Int клеток или моноцитов Ly6C Hi у людей и мышей соответственно.

Хотя моноциты считаются важными клетками, продуцирующими воспалительные цитокины, их вклад в воспалительную среду по сравнению с другими миелоидными клетками кишечника неизвестен. Мы показываем, что при колите у мышей моноциты толстой кишки представляют собой ключевой миелоидный источник IL-1β. Хотя моноциты TNF + также увеличивались в ответ на DSS, в целом миелоидные клетки TNF + встречались реже, чем клетки IL-1β + . Кроме того, моноциты крови вырабатывают значительно больше IL-1β, но не TNF во время DSS-колита при стимуляции LPS, что позволяет предположить, что этот провоспалительный потенциал усиливается еще до выхода из крови.

Кроме того, мы впервые определили транскриптомные различия, связанные со созреванием моноцитов-макрофагов и воспалением в популяциях макрофагов и моноцитов толстой кишки мышей от устойчивого состояния и колита DSS. Интересно, что гены, наиболее активированные по сравнению с моноцитами и макрофагами, были консервативными как в устойчивом состоянии, так и при воспалении и представляли собой хемокины, которые способствуют привлечению моноцитов, включая Ccl7, Ccl8 и Ccl12 (9, 23). Наконец, мы показываем, что CCL7 и CCL8 также были заметно повышены в биопсийном материале человека от активного ВЗК.

В совокупности это предполагает, что и у людей, и у мышей толерогенный статус-кво устойчивых макрофагов нарушается во время воспаления толстой кишки, что способствует привлечению их мощных провоспалительных предшественников моноцитов.

Материалы и методы

Мыши

Самок мышей C57BL / 6 дикого типа (WT) в возрасте 12–22 недель содержали в определенных условиях, свободных от патогенов (SPF) в Университете Манчестера, в соответствии с Законом Соединенного Королевства о животных (научные процедуры) 1986 года.Мышей CX3CR1 + gfp содержали в условиях SPF в Центральном исследовательском центре Университета Глазго (24).

DSS Модель

Мыши получали 2% соль DSS (химическая чистота MW 36 000–50 000 кДа; MP Biomedicals, Solon OH) ad libitum в стерильной питьевой воде в течение 6 дней, как описано ранее (2).

Пациенты и ткани

Проточная цитометрия

Тринадцати пациентам с ВЗК (ЯК или БК), подвергшимся колоноскопии для оценки заболевания, были взяты биопсии из эндоскопически воспаленной (активная ВЗК; 6 образцов от 6 пациентов) или невоспаленной (ВЗК в покое; 10 образцов от 7 пациентов) толстой кишки в дополнение к 4 пациентам посещение колоноскопии для оценки симптомов СРК (здоровые люди; 4 образца от 4 пациентов) для анализа проточной цитометрии.У тех пациентов с неактивной ВЗК, которым было проанализировано более одной биопсии, они были взяты из отдельных сегментов кишечника на расстоянии> 10 см друг от друга, как описано в Таблице 1. Здоровые пациенты контрольной группы прошли нормальную колоноскопию, не имели другого анамнеза в прошлом и не имели окончательного диагноза. любая патология желудочно-кишечного тракта (Таблица 1).

Таблица 1 . Демографические данные пациентов, взятых из биопсии толстой кишки с проточной цитометрией.

RT-qPCR

В отдельной группе из 28 пациентов с ВЗК (ЯК или БК), которым проводилась колоноскопия для оценки заболевания, были взяты биопсии из эндоскопически воспаленной (активная ВЗК; 19 образцов от 17 пациентов) или невоспаленной (неподвижная ВЗК; 12 образцов от 11 пациентов) толстой кишки в в дополнение к восьми пациентам, посещающим колоноскопию для оценки симптомов СРК (здоровые контрольные; 12 образцов от 8 пациентов) для выделения РНК и анализа RT-qPCR.В тех случаях, когда анализировалось более одной биопсии, они были взяты из отдельных сегментов кишечника на расстоянии> 10 см друг от друга, как описано в дополнительной таблице 1. У здоровых контрольных пациентов была нормальная колоноскопия и не было другой истории болезни, и только одному пациенту в конечном итоге был поставлен диагноз СРК (Дополнительная таблица 1). Классификация Монреаля и информация о лекарствах были получены из обзора историй болезни пациентов (таблица 1; дополнительная таблица 1).

Изоляция клеток LP

LP-клеток получали из толстой кишки мыши ферментативным расщеплением, как описано ранее (2).Биопсии толстой кишки человека инкубировали в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS), 1% пенициллин-стрептомицин (PenStrep) (Sigma-Aldrich), G418 (Melford) и 1 мМ DTT (Sigma-Aldrich) в течение 15 минут с последующими тремя 15-минутными промываниями. при 37 ° C с вращением (200 об / мин) с HBSS, PenStrep, G418 и 1 мМ EDTA (Sigma-Aldrich) для удаления эпителиальных клеток. Затем ткань переваривали в 1 мг / мл коллагеназы A (Roche) в 10% FCS RPMI, 1% PenStrep и G418 с 60 ед / мл ДНКазы I (Sigma-Aldrich) в течение 1 ч в инкубаторе с встряхиванием при 37 ° C.По истечении этого времени ткань пропускали через фильтр 40 мкМ, и клетки анализировали с помощью проточной цитометрии или лизировали в буфере RLT (Qiagen) для выделения РНК.

Проточно-цитометрический анализ и сортировка клеток

0,5–2 × 10 6 клеток окрашивали при 4 ° C, как описано ранее, с использованием антител, перечисленных в дополнительной таблице 2 (6). Для обнаружения внутриклеточных цитокинов клетки инкубировали в полной RPMI (Sigma-Aldrich плюс 10% FCS 1% PenStrep) при 37 ° C в 5% CO 2 в течение 3 часов в присутствии 1 мкл / мл GolgiStop (BD Biosciences). .После окрашивания поверхности клетки фиксировали в 1% параформальдегиде, промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и повышали проницаемость с помощью Cytofix / Cytoperm (BD Biosciences). После дополнительного окрашивания PE против TNF и FITC против IL-1β или изотипических контролей в течение 1 часа клетки промывали перед взятием образца. Все окрашенные образцы были получены с использованием LSRFortessa (BD Biosciences) и проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo (TreeStar, Ashland, OR). Число миелоидных клеток на толстую кишку мыши определяли путем расчета доли идентифицированных популяций (фиг. 2A) как доли живых / синглетных / интактных / CD45 + / Lineage клеток.Сумма популяций, представленных на рисунке 2A, составляла> 97% этих клеток. Затем данные миелоидной популяции выражали для каждой толстой кишки мыши с использованием общего числа клеток, полученного после очистки.

Популяции макрофагов и моноцитов очищали с использованием клеточной сортировки, активируемой флуоресценцией (FACS), для последующего анализа экспрессии генов. В устойчивом состоянии CD45 + CD11b + CX3CR1 Int Ly6C + MHC-II моноцитов и CD45 + CD11b + CX3CR1 Hi Ly6C MHC-II + Макрофаги F4 / 80 + были очищены от мышей CX3CR1-GFP, как описано ранее (2).При колите DSS CD45 + Ly6G Siglec-F CD11b + Ly6C + MHC-II +/- моноциты и CD45 + Ly6G Siglec-F CD11b + Ly6C MHC-II + F4 / 80 + макрофаги были отсортированы от мышей C57BL / 6, которые подвергались воздействию DSS в течение 6 дней.

Выделение моноцитов мышиной крови

Кровь получали путем пункции сердца и объединяли с 200 мкл 2 мМ EDTA 3% FCS в PBS для предотвращения коагуляции.Сыворотку аспирировали после осаждения цельной крови при 500 G, 4 ° C в течение 5 минут перед повторным суспендированием гематокрита в 5 мл буфера для лизиса эритроцитов (Sigma-Aldrich) в течение 7 минут для лизирования красных кровяных телец. 2 × 10 6 клеток инкубировали в течение 3 часов при 37 ° C, 5% CO 2 с 1 мкг / мл LPS (Sigma-Aldrich) перед поверхностным / внутриклеточным окрашиванием на CD68, CD11b, Ly6C, маркеры происхождения (NK1 .1, CD19, CD3, Ter119, B220), IL-1β и TNF.

Микроматрица мРНК и количественная ПЦР (кПЦР)

Для образцов толстой кишки мышей или отсортированных популяций клеток общую РНК очищали с использованием мини-наборов RNeasy (Qiagen), как описано ранее (25).Для микрочипов РНК метили с использованием наборов для амплификации РНК TotalPrep (Life Technologies) и гибридизовали с матрицами Illumina MouseWG-6BeadChip с пятью биологическими повторами из одного эксперимента с макрофагами и моноцитами, очищенными с помощью FACS. Данные микрочипов от наивных мышей были получены из набора данных GEO GSE84764 (26). Все анализы проводились в R с использованием Bioconductor. Попарные сравнения групп проводились с использованием линейного моделирования. Впоследствии был применен эмпирический байесовский анализ, включая вертикальную (в рамках данного сравнения) корректировку значений P для множественных испытаний, которая контролирует частоту ложных обнаружений, с использованием пакета limma Bioconductor.

Для RT-qPCR ткани толстой кишки РНК экстрагировали с использованием мини-наборов RNeasy (Qiagen), а комплементарную ДНК генерировали с использованием наборов обратной транскриптазы GoScript (Promega). Относительную количественную оценку интересующих генов проводили с помощью анализа qPCR с использованием системы оптического распознавания текста в реальном времени QuantStudio 12 Flex с Fast SYBR ® Green Master Mix (Life Technologies) по сравнению с серийно разведенным стандартом объединенной комплементарной ДНК. Экспрессия транскрипта была нормализована для гена домашнего хозяйства GAPDH , который существенно не изменялся во время воспаления (данные не показаны).Праймеры перечислены в дополнительной таблице 3.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism v.7 или JMP v.12 (Институт SAS). Данные были проверены, чтобы подтвердить нормальность и то, что группы имели равную дисперсию. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с множественными сравнительными тестами Тьюки был использован для определения значимых различий между группами выборок. Результаты этих тестов были зарегистрированы как значимые, если P <0,05, с результатами этих тестов, показанными как среднее значение ± SEM.Для некоторых экспериментов статистический анализ проводился с использованием JMP, и в этом случае данные были проанализированы с использованием трехфакторных полнофакторных моделей соответствия для оценки эффектов, таких как «генотип», «лечение» и «эксперимент» на интересующей переменной ответа. . Это позволило учесть взаимодействие между эффектами в дополнение к их влиянию на переменную отклика, что позволило объединить экспериментальные повторы, увеличивая мощность анализа (27). Таблица результатов среднего наименьших квадратов трехфакторного полного факторного анализа использовалась для проверки контраста между конкретными экспериментальными группами с использованием совместного F-теста.Различие между экспериментальными группами считалось значимым, если значение P (Prob> F) было <0,05, при этом результаты на графиках показаны как среднее значение наименьших квадратов ± SEM.

Этические соображения

Все образцы были получены в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации, в соответствии с местными этическими директивами и одобрены Северо-Западной национальной службой этики исследований (номер ссылки 15 / NW / 0007). Все пациенты дали письменное информированное согласие на сбор образцов тканей и последующий анализ.

Результаты

Активный IBD толстой кишки человека характеризуется рекрутированием CD14

Hi HLA-DR Int клеток

Доминирующим признаком ВЗК является нарушение местной продукции провоспалительных цитокинов (28). Действительно, длительное введение моноклональных антител против TNF по-прежнему является основой лечения пациентов с осложненным заболеванием (29, 30). Полиморфизмы в IL1B, IL6 и TNF были связаны с предрасположенностью к ВЗК, предполагая, что вариации в способности регулировать продукцию провоспалительных цитокинов связаны с восприимчивостью к заболеванию (31).Поэтому мы использовали кПЦР для оценки «сигнатуры» экспрессии мРНК ключевых воспалительных генов в образцах прицельной биопсии толстой кишки из макроскопически воспаленных или неподвижных областей от пациентов с ВЗК или от здоровых контролей (рисунок 1А; таблица 1). В соответствии с ожиданиями, транскрипты мРНК для TNF, IL1B и IL6 были значительно увеличены в образцах активных ВЗК по сравнению с неактивными ВЗК или здоровыми контрольными образцами пациентов, подтверждая, что эти цитокины являются отличительным признаком активности заболевания (рис. 1A), и это было не зависит от медикаментозного лечения.

Рисунок 1 . Нарушение покоящихся популяций CD14 Hi : CD14 Lo при активной ВЗК. У пациентов с ВЗК были взяты биопсии толстой кишки из макроскопически воспаленных (активная ВЗК) или невоспаленных (покоящаяся ВЗК) областей и сравнивались с биопсиями сигмовидной кишки от здоровых контролей. (A) МРНК , выделенная из образцов биопсии, была проанализирована с помощью кПЦР на экспрессию IL1B, IL6 и TNF со средними значениями относительно GAPDH (12 здоровых контрольных, 12 неподвижных IBD и 19 активных образцов биопсии IBD из 8, 11, 10). и 17 здоровых людей из контрольной группы / пациентов, соответственно, были проанализированы в трех отдельных экспериментах (показаны репрезентативные данные) (дополнительная таблица 1). (B, C) Клетки собственной пластинки толстой кишки были выделены из дополнительных 4 здоровых контрольных, 10 неподвижных образцов IBD и 6 активных образцов биопсии IBD (от 4, 7 и 6 здоровых контролей / пациентов соответственно) и проанализированы с помощью проточной цитометрии Таблица 1). (B) Живые, синглетные клетки линии (CD3, CD19, CD20, CD56) затем оценивали на экспрессию CD14, CD45, CD11c, CD64, CD163 и HLA-DR. Соотношения CD14 Hi и CD14 Lo , Lineage CD45 + и CD14 Hi HLA-DR Hi и HLA-DR int сравнивали в образцах биопсии. (C) Гистограммы CD163 и CD64 в CD14 Hi и CD14 Lo здоровых контролей (левая и средняя панель) и HLA-DR в популяциях CD14 Hi из активных и покоящихся IBD (правая панель) * P <0,05, ** P <0,01, **** P <0,001. а.е., условные единицы.

Мы выдвинули гипотезу, что баланс устойчивых толерогенных макрофагов и провоспалительных моноцитов, вероятно, определяет покоящуюся и воспаленную ткань толстой кишки человека, особенно с учетом того, что в исследованиях на мышах было показано, что эти популяции находятся в континууме (2, 6).Поэтому мы сравнили пропорции макрофагов и моноцитов в биоптатах воспаленной и покоящейся толстой кишки. Хотя различить кишечные макрофаги и моноциты у людей сложнее, чем у мышей, недавняя работа показала, что существует значительная консервация маркеров, которые также определяют кишечные макрофаги мышей, таких как CD14, CD64, CD68, MHC-II и CD163 (2 , 13, 18, 31). Действительно, как и у мышей, у которых зрелость резидентных макрофагов толстой кишки обратно пропорциональна экспрессии Ly6C, считается, что макрофаги человека экспрессируют низкие уровни CD14 (CD14 Lo ), в то время как существует меньшая подгруппа CD14 Hi , которая является более гетерогенной. для экспрессии CD163, HLA-DR и CD209 и может представлять моноциты Ly6C + у мышей (2).Поэтому мы использовали комбинацию экспрессии CD14 и HLA-DR для определения субпопуляций моноцитов / макрофагов человека (дополнительный рисунок 1A) и обнаружили, что при сравнении популяций CD14 + наиболее часто встречались клетки CD14 Lo HLA-DR Hi . в устойчивом состоянии с гораздо меньшей долей клеток CD14 Hi (рис. 1B). Примечательно, что в соответствии с их обозначением как часть клона макрофагов, обе эти популяции экспрессировали высокие уровни CD64 и CD163 (рис. 1C).Мы обнаружили, что пациенты с активным ВЗК демонстрировали поразительное накопление клеток CD14 Hi по сравнению как с покоящимися ВЗК, так и со здоровыми контрольными людьми (рис. 1В), и на это не влияло медикаментозное лечение. Примечательно, что в то время как клетки CD14 Hi в здоровых контрольных и покоящихся образцах IBD экспрессировали высокие уровни HLA-DR, клетки CD14 Hi , обнаруженные при активном IBD, имели профиль HLA-DR Int / Hi , соответствующий более незрелому состоянию. (Рисунки 1B, C). Напротив, в то время как доля макрофагов CD14 Lo при воспалении в значительной степени не изменилась, соотношение клеток CD14 Hi : CD14 Lo значительно изменилось из-за накопления CD14 Hi HLA-DR Int. / Hi популяция (Рисунки 1B, C).

Таким образом, мы показали в наборе данных целевой биопсии из когорты ВЗК толстой кишки, что, аналогично изменениям, которые ранее были описаны у мышей (9), баланс макрофагов CD14 Lo кишечника толстой кишки человека нарушается при активном ВЗК, способствуя накоплению моноцитоподобных клеток CD14 Hi HLA-DR Int .

Колит мышей характеризуется привлечением CD11b

+ Ly6C + CD11c MHC-II +/- Моноциты

Чтобы исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе дисрегулируемой оси CD14 Hi : CD14 Lo и клеточные источники IL-1β и TNF при воспалении толстой кишки, которое мы наблюдали в биопсийном материале человека, и его вклад в воспаление толстой кишки, мы использовали установленной модели экспериментального колита на мышах.Колит DSS характеризуется нарушением эпителиального барьера толстой кишки и последующим воспалением, направленным на инфильтрирующую микробиоту (32, 33). Этот процесс зависит от микробной колонизации кишечника и не зависит от Т- и В-клеток, что позволяет определить участие клеток врожденного иммунитета (33, 34). Однако баланс моноцитов: макрофагов и сравнительная продукция цитокинов во время распространения колита DSS четко не определены. , даже несмотря на то, что эти врожденные клетки были в значительной степени вовлечены в развитие воспалительной патологии в этой модели (2, 9, 35, 36).Использование многопараметрической проточной цитометрии (рисунок 2A) показало, что, как и при биопсии здорового человека (рисунок 1B), толстая кишка мыши содержала большую популяцию макрофагов (определяемых как F4 / 80 + MHC-II + CD64 + CD11b + ) и небольшую популяцию моноцитов (Ly6C + CD11b + MHC-II +/- ; Рисунок 2B) (6). Этот баланс был нарушен при колите, вызванном DSS, что привело к резкому увеличению моноцитов (рис. 2C). Оценка всего миелоидного клеточного компартмента показала, что нейтрофилы (CD11b + Ly6G + ) и моноциты подверглись наибольшему количественному увеличению (9.В 2 и 3,7 раза соответственно), затем следуют эозинофилы (SSC Hi Siglec-F + , изменение в 2,2 раза) и дендритные клетки (DC) (CD11c + F4 / 80 Lo CD64 , изменение в 2,3 раза). Напротив, изменение количества макрофагов было менее драматичным (1,3-кратное изменение) после обработки DSS (Рисунок 2C – слева). Таким образом, в процентном отношении ко всем миелоидным клеткам воспаление индуцировало увеличение моноцитов, нейтрофилов и эозинофилов, наряду с уменьшением доли DC и макрофагов, по сравнению с устойчивым состоянием (рис. 2C – справа).Это показывает, что, как мы наблюдали при активной ВЗК человека, мышиный колит характеризуется резким нарушением соотношения покоящихся моноцитов: макрофагов (Фигуры 1B, 2B).

Рисунок 2 . Производство цитокинов в крови мышей и моноцитах толстой кишки. Мыши WT получали 2% DSS в питьевой воде (или контрольной питьевой воде) в течение 6 дней подряд, клетки собственной пластинки толстой кишки и клеточный компонент крови выделяли и оценивали на экспрессию Siglec-F, Ly6G, CD11b, CD11c, F4 / 80, CD45 и маркеры происхождения (CD3, CD19, NK1.1, Ter119) (толстая кишка) или Ly6C, Lin (NK1.1, CD19, CD3, Ter119, B220), CD11b и CD68 (кровь) с помощью проточной цитометрии. (А) . Репрезентативные контурные графики проточной цитометрии у мышей WT, обработанных DSS, на 6 день с клетками Live / singlet / Lineage CD45 + . (В) . Наименьшее квадратичное среднее отношение общего количества моноцитов LP толстой кишки: макрофаги, идентифицированные из (A) в DSS и контроле питьевой воды (C) . Наименьшее квадратичное среднее общее количество клеток в толстой кишке для популяций в (A), (слева) и их относительные пропорции (справа), n = 15–25 на группу, проанализированные с помощью линейной регрессии шести независимых экспериментов.Среднее наименьшее квадратичное общее количество клеток в толстой кишке (D), – слева и (F), – слева, доля всех, (D), – справа и (F), – справа, и процент от общего числа популяция (E) и (G) , экспрессирующие IL-1β (D) и (E) или TNF (F) и (G) после 3-часовой инкубации с 1 мкл / мл GolgiStop для популяций в (A) , оцененных с помощью внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии, по сравнению с контрольным изотипом антител, n = 12-15 мышей на группу, проанализированных с помощью линейной регрессии трех независимых экспериментов. (В) . Репрезентативные графики проточной цитометрии моноцитов крови, выделенных из контрольных образцов, обработанных DSS или питьевой водой на 6 день, стимулированных 1 мкг / мл LPS и GolgiStop 1 мкл / мл в течение 3 часов и оцененных на экспрессию IL-1β путем внутриклеточного окрашивания с наименьшим средним квадратный% от общего количества моноцитов крови (I) , n = 12–15 мышей на группу, проанализированных методом линейной регрессии трех независимых экспериментов. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0.001, **** P <0,0001, # P <0,0001 для общего количества клеток по сравнению с контролем.

Моноциты толстой кишки при колите мышей экспрессируют высокие уровни IL-1β и TNF

Провоспалительные цитокины IL-1β и TNF высоко экспрессируются в слизистой оболочке пациентов с активным IBD (рис. 1A) (37). Кроме того, хотя мыши, обработанные нейтрализующими антителами к IL-1β, демонстрируют сниженное воспаление DSS и экспрессию транскриптов мРНК IL-6, уровни TNF не изменяются (37), что указывает на то, что IL-1β может играть более доминирующую роль в развитии колита DSS, чем TNF.Недавние данные свидетельствуют о том, что, возможно, немоноцитарные источники IL-1β могут быть важны для инфекции C. rodentium , поскольку химерные мыши (CCR2 WT / Il1b – / – по сравнению с CCR2 WT ), где 50 % моноцитов не обладают способностью продуцировать IL-1β (смесь 1: 1 CCR2 WT / Il1b – / – ) по-прежнему продуцировать то, что кажется эквивалентным IL-1β в супернатанте LP толстой кишки CCR2 WT ( 38). Таким образом, можно предположить, что выход моноцитов из крови в кишечник стимулирует продукцию IL-1β из немоноцитарных источников (38).Поэтому мы напрямую сравнили продукцию провоспалительных цитокинов ex vivo и моноцитами, макрофагами и другими миелоидными клетками в устойчивом состоянии и после введения DSS, используя проточную цитометрию для оценки уровней внутриклеточного IL-1β и белка TNF. Наблюдалось значительное увеличение абсолютного количества макрофагов IL-1β + , DC, моноцитов и, в меньшей степени, нейтрофилов (рис. 2D). Однако на моноциты приходилось наибольшее увеличение после введения DSS в обоих абсолютных числах (12.2-кратное изменение) и пропорции, что составляет 35,7% всех миелоидных клеток IL-1β + (рис. 2D). Мало того, что количество моноцитов IL-1β + было больше при колите DSS, но и доля моноцитов, экспрессирующих IL-1β, значительно увеличилась (в 1,9 раза до 51,7% от всех моноцитов), что было больше, чем у любого другого IL-1β, экспрессирующего миелоид. население (рис. 2E). Таким образом, несмотря на то, что во время DSS-колита существовали различные миелоидные источники IL-1β, моноциты были наиболее чувствительной и заметной популяцией IL-1β + , претерпевавшей наибольшие количественные и клеточные изменения в этих условиях.Таким образом, влияние моноцитов толстой кишки на воспаление во время DSS-колита, вероятно, является сложным эффектом увеличения выработки IL-1β на клетку вместе с повышенным рекрутингом.

По сравнению с IL-1β + , было гораздо меньше кишечных миелоидных клеток, которые были TNF + в устойчивом состоянии или во время колита DSS (сравните Фигуры 2D, F). Макрофаги были наиболее доминирующей популяцией TNF + , независимо от воспаления, но демонстрировали лишь небольшие изменения в общем количестве после введения DSS.Как видно из секреции IL-1β, из субпопуляций миелоидных клеток TNF + моноциты увеличились больше всего после введения DSS (5,6-кратное изменение) и увеличились пропорционально, составляя 21,1% от всех миелоидных клеток TNF + . Однако, в отличие от IL-1β, не наблюдалось значительного увеличения доли моноцитов, экспрессирующих TNF.

Моноциты крови при колите мышей являются патогенными до попадания в участки воспаленной ткани

Учитывая, что доля моноцитов IL-1β + толстой кишки мыши увеличилась более резко, чем любая другая миелоидная популяция в DSS (рис. 2E), мы задались вопросом, отражает ли это повышенную способность моноцитов реагировать на воспаленную микросреду, и / или в результате системной подготовки к провоспалительному действию до попадания на слизистую оболочку.Чтобы решить эту проблему, мы культивировали моноциты, выделенные из крови обработанных DSS или контрольных мышей ex vivo в присутствии или в отсутствие LPS, и оценили их продукцию провоспалительного IL-1β и TNF с помощью внутриклеточной проточной цитометрии. Ly6C Hi CD11b + CD68 + моноциты крови животных, получавших DSS, показали значительно большую долю клеток, экспрессирующих IL-1β, но не TNF (рисунки 2H, I; дополнительный рисунок 1B), аналогично ответам, наблюдаемым на моноциты толстой кишки (Рисунки 2E, G).Кроме того, ни IL-1β, ни TNF не обнаруживались в моноцитах крови в отсутствие стимуляции LPS, что свидетельствует о незначительных уровнях экспрессии базальных цитокинов.

Воспаление толстой кишки у мышей изменяет экспрессию сходных генов стресс-ответа ER как в макрофагах, так и в моноцитах

Затем мы попытались понять, как нарушенный баланс моноцитов: макрофагов, который мы идентифицировали при колите у мышей и людей, связан с измененной экспрессией генов этими ключевыми миелоидными клетками. Макрофаги и моноциты LP толстой кишки очищали с помощью FACS от контрольных мышей и мышей, обработанных DSS, экстрагировали РНК и анализировали с помощью микроматрицы транскриптома.Во-первых, мы изучили влияние воспаления толстой кишки на экспрессию мРНК моноцитов и макрофагов. Путем сравнения популяций мышей, получавших DSS, и мышей, не подвергавшихся воздействию, мы идентифицировали 1446 генов в макрофагах (924 гены с пониженной и 522 повышающей регуляции) и 1284 гена в моноцитах (858 понижающих и 426 повышающих регуляторов), которые были значительно изменены (Log2-кратно). изменение ≥ 2, P <0,01; рисунок 3A). Из них 151 из 200 генов, экспрессируемых наиболее по-разному (т. Е. Наибольшая абсолютная кратность 100 генов, изменяющих вверх и 100 генов вниз), были одинаковыми как в макрофагах, так и в моноцитах (DSS vs.наивно). Это предполагает, что воспаление вызывает аналогичные изменения экспрессии мРНК как в кишечных макрофагах, так и в моноцитах. Наибольшее кратное изменение экспрессии генов произошло в транскриптах мРНК рибосомных белков и в ER стрессе ( Eif3k, Rpl13a, Rpl31, Rpl37 ), все из которых были сходными как в макрофагах, так и в моноцитах (рис. 3B) (39, 40, 41). ). Действительно, анализ KEGG показал, что наиболее значимым путем был «процессинг белка в ER», который подавлялся после DSS как в моноцитах, так и в макрофагах (рис. 3C).

Рисунок 3 . Экспрессия хемокинов повышена в воспаленных макрофагах толстой кишки мыши и активном ВЗК человека. Макрофаги собственной пластинки толстой кишки и популяции моноцитов были изолированы и очищены с помощью проточной цитометрии, начиная с 6-го дня. 2% DSS (CD11b + MHC-II + Lineage Ly6C макрофаги, CD11b + MHC-II + / – Lineage Ly6C + моноцитов) или наивных мышей. РНК экстрагировали, и экспрессию генов оценивали гибридизацией с микрочипом IlluminaMouseRef6 (2% DSS) или чипом Affymetrix5 (Naïve). (А) . Графики вулканов значимости Log10 и Log2-кратного изменения для сравнения экспрессии генов DSS и наивных макрофагов и моноцитов. (В) . Тепловая карта выбранной нормализованной экспрессии гена из (A) (скорректировано P <0,01), каждая отдельная тепловая карта представляет собой биологическую копию, состоящую из 2–5 объединенных мышей. (C) Анализ путей KEGG значимых (скорректированный P <0,01) путей из (A) . (Д) .Графики вулканов значимости Log10 и Log2-кратного изменения для сравнения экспрессии генов моноцитов и макрофагов в DSS и в устойчивом состоянии. (E) . Тепловая карта выбранной нормализованной экспрессии гена из D (скорректированная P <0,01) каждая отдельная тепловая карта представляет собой биологическую копию, состоящую из 2–5 объединенных мышей. (F) Анализ пути KEGG значимых (скорректированный P <0,01) путей из (D) . (Г) . У пациентов с ВЗК были взяты биопсии толстой кишки из макроскопически воспаленных или невоспаленных участков и сравнивались с биопсиями здоровых людей.мРНК, выделенную из образцов биопсии, анализировали с помощью кПЦР на экспрессию CXCL1, CCL7 и CCL8 со средними значениями относительно GAPDH (12 здоровых контрольных, 12 неподвижных IBD и 19 активных образцов биопсии IBD от 8, 11 и 17 здоровых контрольных / пациентов. , соответственно, были проанализированы в трех отдельных экспериментах, показаны репрезентативные данные) (дополнительная таблица 1). * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001. а.е., условные единицы.

Созревание от моноцитов толстой кишки мыши к макрофагам изменяет экспрессию гена хемокина независимо от воспаления

Затем мы изучили влияние созревания моноцитов на макрофаги на профили экспрессии мРНК у наивных мышей или мышей, получавших DSS. Сравнение экспрессии генов макрофагов и моноцитов мышей DSS выявило 44 гена (27 с отрицательной и 17 с повышающей регуляцией) и 308 генов от наивных мышей (196 с пониженной и 112 с повышающей регуляцией) были выражены в Log2-кратное изменение ≥ 2 ( Р <0.01; Рисунок 3D). И снова было обнаружено поразительное сходство, не зависящее от воспаления, с 73/200 из 100 наибольших абсолютных кратных изменений повышающих и понижающих регулируемых генов, идентичных в устойчивом состоянии и DSS при сравнении экспрессии генов макрофагов и моноцитов. Гены, наиболее высоко экспрессируемые в макрофагах по сравнению с моноцитами как при здоровье, так и при воспалении, были хемокинами (Фигуры 3E, F). В частности, экспрессия мРНК макрофагов Ccl7, Ccl8, Ccl12 и Cxcl1 была значительно повышена по сравнению с моноцитами как в наивных, так и в воспаленных условиях (рис. 3E).Это говорит о том, что в толстой кишке макрофаги, полученные из моноцитов, быстро развивают способность продуцировать хемокины, которые будут способствовать привлечению как их собственных предшественников моноцитов, так и нейтрофилов (39), при этом высокий уровень экспрессии этих генов сохраняется в макрофагах независимо от воспаления. Кроме того, сравнение моноцитов от DSS и наивных мышей показало повышенную экспрессию Ccl7, Ccl8 и Cxcl1 при воспалении (фигура 3E).

Удивительно, но Ccl2 и Ccl3 , которые являются важными медиаторами рекрутирования моноцитов и макрофагов, не экспрессировались на значительно разных уровнях по сравнению с моноцитами и макрофагами ни в стабильном состоянии, ни во время воспаления (рис. 3E) (7, 9, 38, 40).Фактически, уровни этих транскриптов были значительно снижены как в моноцитах, так и в макрофагах при сравнении воспаленных и наивных параметров (рис. 3E).

Выявив отличительную сигнатуру хемокинов в миелоидных клетках, выделенных из мышиного колита, мы затем попытались оценить, проявляется ли подобный паттерн измененной экспрессии хемокинов во время человеческого колита. Целевые биопсии толстой кишки из контрольной, покоящейся IBD и активной IBD были проанализированы на экспрессию мРНК CCL7, CCL8 и CXCL1 на основе данных нашего массива мышей.Как и в случае мышиного колита, CCL7, CCL8 и CXCL1 были значительно увеличены при активной IBD по сравнению с покоящейся IBD и контрольной группой (фигура 3G).

Эти данные демонстрируют сравнительные эффекты воспаления кишечника на сигнатуры мРНК моноцитов и макрофагов толстой кишки, идентифицируя измененную экспрессию в макрофагах и моноцитах генов, которые стабилизируют функцию рибосом во время стресса ER, вызванного воспалением, и хемокинов, участвующих в стимулировании рекрутирования моноцитов, вызванных моноцитами. -дифференцировка макрофагов.

Обсуждение

ВЗК характеризуется ремиттирующим рецидивирующим воспалением с неопределенным патогенезом, которое при БК может возникать в любом месте желудочно-кишечного тракта, а при ЯК – почти исключительно в толстой кишке. Однако существующие данные о врожденной иммунной системе при ВЗК в основном сосредоточены на фенотипировании иммунных клеток тонкого кишечника, изолированного или в сочетании тонкого и толстого кишечника, а не только толстой кишки (2, 12, 14, 21, 22). . Даже в моделях колита на мышах плохо описаны изменения, вызванные воспалением относительного количества различных миелоидных клеток и их относительной частоты, пропорции и цитокиновых ответов.В нашем исследовании использовался как целевой биопсийный материал из когорты ВЗК толстой кишки, так и модель колита на мышах, чтобы показать, что воспаление резко изменило состав миелоидного компартмента толстой кишки.

Наивные моноциты толстой кишки быстро дифференцируются в резидентные макрофаги после попадания в кишечник, что приводит к значительному изменению функции в сторону толерантности микробиоты (2). Однако сравнение изменений экспрессии генов, сопровождающих процесс дифференцировки в устойчивом состоянии, по сравнению своспаление толстой кишки или различия в экспрессии моноцитов и макрофагов толстой кишки до и после колита неизвестны.

Мы наблюдали, что активный IBD толстой кишки человека был связан со значительно большей экспрессией мРНК толстой кишки TNF, IL1B, IL6 и соотношениями CD14 Hi : CD14 Lo и HLA-DR Int : HLA-DR Hi Клетки против покоящихся ВЗК и здоровых контролей. Это согласуется с предыдущей работой, в которой сообщалось об увеличении количества клеток CD14 Hi в воспаленной слизистой оболочке кишечника, которые имеют черты менее зрелых мононуклеарных клеток, хотя наши данные являются одними из первых с использованием эксклюзивного набора данных целевых биопсий толстой кишки, сравнивающих активные и покоящиеся ВЗК у здоровых людей (14).В самом деле, определение роли кишечных клеток CD14 Hi было несколько затруднено из-за различных методологий (в частности, различий в выборке анатомической локализации) и подклассификации в литературе (2, 11–14). Поскольку мы были ограничены только оценкой здоровой контрольной сигмовидной кишки в нашей представленной работе, будущие исследования потребуются для выяснения того, изменяет ли ВЗК эти популяции в различной степени в разных областях толстой кишки.

CD14 Hi Клетки HLA-DR Hi из образцов хирургической резекции CD / UC могут индуцировать дифференцировку наивных Т-клеток в клетки Th27 с субпопуляцией CD163 Lo , способной производить больше IL-1β и IL-6 после стимуляции TLR по сравнению с макро / микроскопически нормальными областями после резекций рака толстой кишки (13).Аналогичным образом Камада и др. сообщили об увеличении продуцирования IL-6, TNF и IL-23 клеток CD14 + CD33 + в образцах хирургической резекции UC / CD по сравнению с контрольной группой, причем Thiesen et al. (объединенные образцы тонкой и толстой кишки) и Magnusson et al. (дискретные образцы тонкой и толстой кишки), сообщающие об увеличении клеток CD14 Hi HLA-DR Int при активном и покоящемся ВЗК и здоровом контроле (11, 12, 14). Это подчеркивает, что повышенное количество кишечных клеток CD14 Hi в толстой кишке может быть надежным индикатором тяжести ВЗК.

Исследование модели мышиного колита позволило нам точно определить числовые и пропорциональные изменения миелоидного компартмента толстой кишки. Отражая повышенное соотношение CD14 Hi : CD14 Lo в толстой кишке, наблюдаемое при активном ВЗК человека, мышиный колит характеризовался повышением моноцитов Ly6C Hi CD64 + до Ly6C CD64 + F4 / 80 + Соотношение макрофагов . Популяции моноцитов и нейтрофилов были наиболее чувствительны (по кратному изменению) к числовому расширению, вызванному DSS, с соответствующим значительным снижением доли макрофагов и DC в миелоидном компартменте.Таким образом, одним из отличительных признаков колита мыши и человека является накопление моноцитарных (мышиных) или моноцитоподобных (человека) клеток, так что они подвергаются значительному количественному увеличению после начала воспаления и составляют значительную часть миелоидного компартмента. по сравнению с состоянием покоя.

В дополнение к идентификации этой связи между тяжестью колита и увеличением количества тканевых моноцитов, мы впервые показали относительную продукцию ключевых воспалительных цитокинов IL-1β и TNF кишечными миелоидными клетками при колите DSS, выявив моноциты как доминирующий IL. -1β продуцирующая популяция.Это проявлялось как в увеличении продукции IL-1β на клетку, так и в увеличении количества моноцитов IL-1β + по сравнению с другими миелоидными клетками. DSS не увеличивал продукцию TNF на клетку ни в одной популяции миелоидных клеток. Следовательно, в отличие от IL-1β, увеличение количества моноцитов TNF + после DSS было связано с увеличением рекрутирования и накопления моноцитов, а не с увеличением продукции этого цитокина на клетку. Важность кишечных моноцитов, продуцирующих IL-1β, для надлежащего клиренса Citrobacter spp была недавно показана, где моноциты CCR2 + дают начало макрофагам, которые индуцируют IL-22 из клеток ILC3 зависимым от IL-1β образом (38). .Здесь мы идем дальше, показав, что во время DSS-колита макрофаги, DC и нейтрофилы в толстой кишке могут продуцировать IL-1β в дополнение к моноцитам.

В дополнение к оценке тканевых моноцитов, мы обнаружили, что моноциты крови мышей продуцируют повышенное содержание IL-1β, но не TNF, во время колита DSS. Это может указывать на то, что воспаление кишечника передает системные сигналы моноцитам крови, увеличивая их потенциал продуцирования IL-1β. Кроме того, ни IL1-β, ни TNF не были обнаружены в отсутствие стимуляции LPS, что свидетельствует о незначительных уровнях экспрессии базальных цитокинов и о том, что провоспалительные цитокины моноцитов будут высвобождаться только при входе в ткань и вовлечении TLR.Хотя конкретные системные сигналы, которые могут сообщать повышенный потенциал IL-1β в крови, еще не известны, недавно было высказано предположение, что продукция IFN-γ NK-клетками может влиять на предшественников моноцитов в костном мозге, чтобы принять регуляторный фенотип во время острой желудочно-кишечной инфекции. , процесс, предшествующий возникновению системного воспаления (41). Действительно, колонки для адсорбции гранулоцитов / моноцитов (GMA) в настоящее время исследуются в качестве терапии для снижения циркулирующих моноцитов в крови CD14 + CD16 + у пациентов с активной ВЗК (16).Интересно, что пациенты, получавшие GMA на ранней стадии, демонстрируют более доброкачественное течение заболевания, что позволяет предположить, что острое, а не установленное воспаление более поддается вмешательству на моноцитах (42).

Хотя мы наблюдали моноциты как определяющий признак воспаления толстой кишки как у мышей, так и у человека, важно отметить, что их макрофаги-потомки также считаются важными составляющими процесса репарации. Например, мыши Ccr2 – / – секвестрируют моноциты в BM (43), что приводит к истощению тканевых резидентных макрофагов, снижая их восприимчивость к острому колиту DSS, но повышая восприимчивость к хроническому DSS-опосредованному воспалению (7, 44).И наоборот, условное истощение моноцитов CCR2 + с использованием мышей CCR2 DTR увеличивает восприимчивость к кишечной инфекции Citrobacter . Это демонстрирует тонкий баланс моноцитов-макрофагов, необходимый для отражения кишечной инфекции, ограничения потенциально повреждающего рекрутирования моноцитов, а также устранения повреждения тканей. Следовательно, стратегии, направленные на модуляцию провоспалительных моноцитов во время ВЗК, могут иметь «окно возможностей» при остром заболевании, которое должно быть сбалансировано с учетом важности макрофагов, полученных из моноцитов, в разрешении хронического воспаления кишечника и самих моноцитов в борьбе с оппортунистической кишечной инфекцией.

Чтобы определить механизмы, которые контролируют количество моноцитов и макрофагов и их роль в развитии колита, мы сравнили профили мРНК очищенных моноцитов и макрофагов толстой кишки от мышей, получавших DSS, и контрольных мышей. DSS вызывал аналогичные изменения экспрессии генов как моноцитов, так и макрофагов по сравнению с устойчивым состоянием. Анализ путей показал, что основные пути дисрегуляции в обеих популяциях были связаны со стрессом ER и локусами, связанными с развернутым белковым ответом (UPR) ( Eif3k, Rpl13a подавлялись при DSS и Rpl31 и Rpl37 повышались при DSS). Eif3k , например, кодирует субъединицу k эуркариотического фактора инициации 3 (eIF3), который является важным компонентом стрессовых гранул, индуцированных ER. Интересно, что c-субъединица eIF3 ( EIF3C ) была идентифицирована как локус восприимчивости к риску IBD в педиатрических популяциях с ранним началом (45), а белок eIF3 обнаружен в повышенных уровнях в слизистой оболочке толстой кишки пациентов с UC (46). Это предполагает, что снижение экспрессии мРНК Eif3k в моноцитах / макрофагах, по нашим данным, является частью механизма компенсации повышенного стресса ER в этих популяциях во время колита (46).Другой главный подавляемый ген, Rpl13a , кодирует рибосомный белок, который является частью комплекса активированного IFN-γ ингибитора трансляции (GAIT), который связывает нетранслируемые области нескольких мРНК цитокинов во время воспаления. Миелоид-специфический нокаут Rpl13a делает хозяина восприимчивым к LPS-индуцированной эндотоксемии и DSS-колиту (47, 48). Rpl13 -дефицитные макрофаги также демонстрируют нерегулируемую экспрессию CCL8, что позволяет предположить, что подавление Rpl13a , которое мы наблюдали в кишечных макрофагах, является частью ответа хозяина на нарушение барьера, вызванное DSS, что позволит увеличить набор цитокинов, продуцирующих воспалительные моноциты (47).Функция других рибосомных белков в опосредовании ответов макрофагов / моноцитов во время колита недостаточно изучена. Однако Rpl31 и Rpl37 , экспрессия которых значительно увеличивалась макрофагами / моноцитами во время DSS-воспаления, участвуют в клеточном цикле бактерий и рака и предотвращают апоптоз, опосредованный p53 (49-51). Следовательно, повышенная экспрессия транскриптов Rpl31 / 37 и UPR моноцитами / макрофагами после введения DSS может позволить этим клеткам работать во враждебной среде, облегчая трансляцию белка и поддерживая ключевые клеточные процессы для выживания.

Сравнение изменений экспрессии мРНК между макрофагами толстой кишки и моноцитами выявило высококонсервативный набор генов, который не зависел от воспаления, вызванного DSS. Ряд хемокинов, привлекающих моноциты и нейтрофилы ( Ccl7, Ccl8, Cxcl1 ), был более высоко экспрессирован в макрофагах по сравнению с моноцитами как из устойчивого состояния, так и из DSS-колита. Кроме того, экспрессия этих транскриптов хемокинов была повышена в моноцитах мышей, получавших DSS, по сравнению с наивными мышами. Это показывает, что экспрессия этих транскриптов хемокинов была повышена в глобальном масштабе при колите, что также было очевидно при сравнении образцов толстой кишки человека из активных и активных клеток.покоящаяся IBD и контроли. Существует множество хемокинов (CCL2, CCL7, CCL8 и CCL12), которые, как сообщается, рекрутируют классические моноциты CCR2 + (7, 9). Из них CCL2, как известно, является важным лигандом для CCR2, хотя его роль в колите неясна, поскольку у мышей Ccl2 – / – , обработанных DSS, было показано, что у мышей развивается либо обострение, либо улучшение колита (52, 53). В отличие от других хемокинов моноцитов, мы обнаружили, что экспрессия Ccl2 и была эквивалентна между моноцитами и макрофагами.Однако интересно, что экспрессия Ccl2 была фактически снижена как в моноцитах, так и в макрофагах при сравнении популяций до и после DSS. Это говорит о том, что макрофаги и моноциты не являются ключевым источником высвобождения CCL2 во время колита. Важность CCL7, CCL8, CCL12 и CXCL1 в опосредовании воспаления при колите и последствия повышенной экспрессии этих хемокинов в моноцитах при патологии неизвестны. Хотя сообщалось, что макрофаги CD169 + экспрессируют Ccl2, Ccl7 и Ccl8 во время колита (вклад моноцитов не учитывался) (9, 54), а анализ срезов ВЗК толстой кишки предложил CCL8 в качестве Наибольший уровень активности хемокинов, выделяемых воспалительными клетками (55).Поэтому, поскольку наше исследование напрямую сравнивает транскриптомы кишечных моноцитов и макрофагов как в наивных, так и в воспаленных условиях, мы предполагаем, что макрофаги толстой кишки при колите являются важными источниками CCL7 / 8 и что, кроме того, моноциты в воспаленных условиях обладают повышенной способностью экспрессировать Ccl7 / 8 , что делает возможным дальнейшее проникновение моноцитов в участки воспаленной ткани.

В совокупности наши данные на мышах и людях предполагают, что рекрутирование моноцитов и системное праймирование высвобождения моноцитарного IL-1β являются ключевыми компонентами, участвующими в эскалации воспаления толстой кишки при колите.Таким образом, целенаправленное вмешательство хемокинов, рекрутирующих моноциты, таких как CCL7, CCL8 или CXCL1 , может помочь сохранить устойчивый баланс моноцитов: макрофагов, который нарушается при патологических воспалительных состояниях, таких как ВЗК. Элегантные исследования показали, что макрофаги толстой кишки взрослых мышей развиваются из моноцитов крови Ly6C Hi CCR2 + в моноциты толстой кишки Ly6C + CD11b + и созревают макрофаги F4 / 80 + CX3CR1 Hi , процесс который также характеризуется резким изменением функции и фенотипа, как описано выше (2, 8, 10).Таким образом, модуляция представительства моноцитов или макрофагов, вероятно, изменит провоспалительную способность желудочно-кишечного тракта.

Заключение

Таким образом, мы показали накопление провоспалительных моноцитов как при колите у мышей, так и при ВЗК человека, и предполагаем, что нацеливание на эти моноциты или их рекрутирование макрофагами может представлять собой новую и захватывающую терапию будущего для лечения воспаления кишечника.

Авторские взносы

G-RJ и ПК: концепция и дизайн исследования, сбор данных, анализ и интерпретация данных, составление рукописи, критический пересмотр рукописи на предмет важного интеллектуального содержания; AK, TF, SB и CB: сбор данных, составление рукописи, критический пересмотр рукописи на предмет важного интеллектуального содержания; AI: анализ и интерпретация данных, составление рукописи, критическая редакция рукописи на предмет важного интеллектуального содержания; AM и MT: концепция и дизайн исследования, интерпретация данных, критический пересмотр рукописи на предмет важного интеллектуального содержания.Все авторы одобрили окончательную рукопись.

Финансирование

Эта работа была поддержана Советом по медицинским исследованиям (G0701437) и основным финансированием от Манчестерского центра исследований воспаления при AM. G-RJ поддерживается программой клинической академической подготовки Wellcome Trust Edinburgh (100469 / Z / 12 / Z). PC поддерживается стипендией для научных исследований в области раннего развития карьеры декана Манчестерского университета и премией «трамплин» (Академия медицинских наук, SBF002 / 1076). MT поддерживается Советом по медицинским исследованиям (MR / M00242X / 1) и основным финансированием от Wellcome Trust Center for Cell-Matrix Research.Центр исследований клеточной матрицы Wellcome при Манчестерском университете финансируется фондом Wellcome Trust (грант № 203128 / Z / 16 / Z). CB имеет стипендию сэра Генри Дейла, совместно финансируемую Wellcome Trust и Королевским обществом (206234 / Z / 17 / Z).

Заявление о конфликте интересов

Манчестерский центр исследований воспалений – совместное предприятие Манчестерского университета и GSK. Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Эксперименты Illumina BeadChip были выполнены Луизой Эвенден и Ли Мерфи в Центре клинических исследований Wellcome Trust, Эдинбургский университет. Мы благодарим Гарета Хауэлла за сортировку клеток и помощь в рамках основного центра проточной цитометрии Университета Манчестера и SB за техническую поддержку.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389 / fimmu.2018.02764 / полный # дополнительный материал

Дополнительный рисунок 1 . (A) Типичная стратегия гейтирования с помощью проточной цитометрии для идентификации живых / синглетных / Lineage / CD45 + HLA-DR + клеток из собственной пластинки толстой кишки. (B) Клеточный компонент крови выделяли из контрольных образцов, обработанных DSS или питьевой водой на 6 день, и стимулировали 1 мкг / мл LPS и GolgiStop 1 мкл / мл в течение 3 часов. CD11b + CD68 + Ly6C Моноциты крови Hi были идентифицированы с помощью проточной цитометрии и оценены на экспрессию TNF с помощью внутриклеточного окрашивания, n = 12-15 мышей на группу проанализированы с помощью линейной регрессии трех независимых экспериментов.

Дополнительная таблица 1 . Демографические данные пациента с образцом биопсии толстой кишки КПЦР Для выделения РНК и анализа RT-qPCR были получены двенадцать здоровых контрольных, 12 неподвижных IBD и 19 активных IBD образцов биопсии толстой кишки от 8 здоровых контрольных, 11 неподвижных IBD и 17 активных пациентов IBD, посещающих колоноскопию. Карты пациентов были проанализированы на предмет демографических данных, местоположения ВЗК и поведения болезни по Монреальской классификации. IM, иммуномодулирующие препараты; Метотрексат, метотрексат; ADA, адалимумаб; IFX, инфликсимаб; 6’MP, 6-меркаптопурин; 5’ASA, 5’аминосалициловая кислота.Монреальская классификация CD: A1, возраст начала <16 лет; A2 - от 17 до 40 лет; A3,> 40 лет. L1 – поражение подвздошной кишки; L2 – локализация заболевания толстой кишки; L3, локализация илеоколонической болезни. B1 – воспалительный фенотип; B2 – строгий фенотип; B3, проникающий фенотип. Монреальская классификация ЯК: E1, проктит; E2, ректосигмоидная болезнь; E3, заболевание проксимальнее селезеночного изгиба. CD – болезнь Крона; ЯК, язвенный колит. # Идентификатор пациента – это идентификатор, присвоенный каждому человеку, предоставляющему ткань, чтобы можно было идентифицировать доноров, сдавших более 1 образца.

Дополнительная таблица 2 . Детали антител проточной цитометрии.

Дополнительная таблица 3 . Детали праймера qPCR.

Список литературы

2. Bain CC, Scott CL, Uronen-Hansson H, Gudjonsson S, Jansson O, Grip O, et al. Резидентные и провоспалительные макрофаги в толстой кишке представляют собой альтернативные контекстно-зависимые судьбы одних и тех же предшественников моноцитов Ly6Chi. Иммунол слизистой оболочки . (2013) 6: 498–510. DOI: 10,1038 / миль.2012.89

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3.Андерсон К.А., Бушер Дж., Лис К.В., Франке А., Д’Амато М., Тейлор К.Д. и др. Мета-анализ выявил 29 дополнительных локусов риска язвенного колита, увеличив количество подтвержденных ассоциаций до 47. Nat Genet . (2011) 43: 246–52. DOI: 10,1038 / нг.764

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Куни Р., Бейкер Дж., Брейн О, Данис Б., Пичулик Т., Аллан П. и др. Стимуляция NOD2 вызывает аутофагию в дендритных клетках, влияя на обработку бактерий и презентацию антигена. Нат Мед . (2009) 16: 90–7. DOI: 10,1038 / нм.2069

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Bain CC, Bravo-Blas A, Scott CL, Perdiguero EG, Geissmann F, Henri S и др. Постоянное пополнение циркулирующими моноцитами поддерживает пул макрофагов в кишечнике взрослых мышей. Нат Иммунол . (2014) 15: 929–37. DOI: 10.1038 / ni.2967

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Platt AM, Bain CC, Bordon Y, Sester DP, Mowat AM.Независимая подгруппа TLR, экспрессирующая CCR2-зависимые макрофаги, способствует воспалению толстой кишки. Дж Иммунол . (2010) 184: 6843–54. DOI: 10.4049 / jimmunol.07

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Риволье А., Хе Дж., Коле А., Валатас В., Келсалл Б.Л. Воспаление переключает программу дифференцировки моноцитов Ly6Chi с противовоспалительных макрофагов на воспалительные дендритные клетки в толстой кишке. J Exp Med . (2012) 209: 139–55.DOI: 10.1084 / jem.20101387

CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Зигмонд Э., Варол С., Фараче Дж., Элмалия Э., Сатпатия А.Т., Фридлендер Г. и др. Моноциты в воспаленной толстой кишке дают начало провоспалительным эффекторным клеткам и мигрирующим антигенпрезентирующим клеткам. Иммунитет (2012) 37: 1076–90. DOI: 10.1016 / j.immuni.2012.08.026

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Арнольд И.К., Матисен С., Шультесс Дж., Данн С., Хегази А.Н., Паури Ф.Моноциты / макрофаги CD11c + способствуют развитию хронического кишечного воспаления, индуцированного Helicobacter hepaticus , посредством продукции IL-23. Иммунол слизистой оболочки . (2016) 9: 352–63. DOI: 10,1038 / mi.2015.65

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Камада Н., Хисамацу Т., Окамото С., Чинен Х., Кобаяси Т., Сато Т. и др. Уникальные кишечные макрофаги CD14 вносят вклад в патогенез болезни Крона через ось IL-23 / IFN-гамма. Дж Клин Инвест . (2008) 118: 2269–80. DOI: 10.1172 / JCI34610

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Тизен С., Янчаускене С., Уронен-Ханссон Х., Агас В., Хёгеркорп С.М., Спее П. и др. Макрофаги CD14hiHLA-DRdim, похожие на классические моноциты крови, доминируют в воспаленной слизистой оболочке при болезни Крона. Дж Лейкок Биол . (2014) 95: 531–41. DOI: 10.1189 / jlb.0113021

CrossRef Полный текст | Google Scholar

13.Огино Т., Нисимура Дж., Бармен С., Каяма Х., Уэмацу С., Окузаки Д. и др. Повышенная Th27-индуцирующая активность CD14. Гастроэнтерология (2013) 145: 1–13. DOI: 10.1053 / j.gastro.2013.08.049

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Магнуссон М.К., Бриньольфссон С.Ф., Диге А., Уронен-Ханссон Х., Бёрьессон Л.Г., Бенгтссон Д.Л. и др. Субпопуляции макрофагов и дендритных клеток при ВЗК: количество клеток ALDH + уменьшается в ткани толстой кишки пациентов с язвенным колитом независимо от воспаления. Иммунол слизистой оболочки . (2016) 9: 171–82. DOI: 10,1038 / mi.2015.48

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Гримм М.К., Пуллман В.Е., Беннетт Г.М., Салливан П.Дж., Павли П., Доу В.Ф. Прямое свидетельство рекрутирования моноцитов в слизистую оболочку воспалительного заболевания кишечника. Дж Гастроэнтерол Гепатол . (1995) 10: 387–95. DOI: 10.1111 / j.1440-1746.1995.tb01589.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Йошимура Н., Йокояма Й., Мацуока К., Такахаши Х., Ивакири Р., Ямамото Т. и др.Открытое проспективное рандомизированное многоцентровое исследование интенсивного и еженедельного афереза ​​гранулоцитов и моноцитов при активной болезни Крона. БМК Гастроэнтерол . (2015) 15: 163. DOI: 10.1186 / s12876-015-0390-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Махида Ю. Р., Патель С., Джиончетти П., Во Д., Джуэлл Д. П.. Субпопуляции макрофагов в собственной пластинке нормальной и воспаленной толстой кишки и терминальной части подвздошной кишки. Кишечник (1989) 30: 826–34.

PubMed Аннотация | Google Scholar

18.Rogler G, Hausmann M, Vogl D, Aschenbrenner E, Andus T, Falk W. и др. Выделение и фенотипическая характеристика макрофагов толстой кишки. Клин Эксперимент Иммунол . (1998) 112: 205–15. DOI: 10.1046 / j.1365-2249.1998.00557.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Девосс Т., Гийаберт А., Д’Хейн Н., Бертон А., Де Надаи П., Ноэль С. и др. Формилпептидный рецептор-подобный 2 экспрессируется и функционирует в плазматических дендритных клетках, тканеспецифических субпопуляциях макрофагов и эозинофилах. Дж Иммунол . (2009) 182: 4974–84. DOI: 10.4049 / jimmunol.0803128

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Клейнен И., Бушер Г., Йостинс Л., Шумм Л.П., Цейссиг С., Ахмад Т. и др. Унаследованные детерминанты фенотипов болезни Крона и язвенного колита: исследование генетической ассоциации. Ланцет (2016) 387: 156–67. DOI: 10.1016 / S0140-673600465-1

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Камада Н., Хисамацу Т., Окамото С., Сато Т., Мацуока К., Араи К. и др.Аномально дифференцированные подмножества кишечных макрофагов играют ключевую роль в Th2-доминантном хроническом колите из-за избыточной продукции IL-12 и IL-23 в ответ на бактерии. Дж Иммунол . (2005) 175: 6900–8. DOI: 10.4049 / jimmunol.175.10.6900

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Ругтвейт Дж., Нильсен Э.М., Бакка А., Карлсен Х., Брандтзаег П., Скотт Х. Профили цитокинов различаются в недавно набранных и резидентных подмножествах макрофагов слизистой оболочки от воспалительного заболевания кишечника. Гастроэнтерология (1997) 112: 1493–505.

PubMed Аннотация | Google Scholar

23. Асано К., Такахаши Н., Ушики М., Моня М., Айхара Ф., Кубоки Э. и др. Кишечные макрофаги CD169 + инициируют воспаление слизистой оболочки, секретируя CCL8, который рекрутирует воспалительные моноциты. Нац Коммуна . (2015) 6: 7802. DOI: 10.1038 / ncomms8802

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Юнг С., Алиберти Дж, Грэммель П., Саншайн М.Дж., Кройцберг Г.В., Шер А. и др.Анализ функции фракталкинового рецептора CXCR1 путем целенаправленной делеции и вставки репортерного гена зеленого флуоресцентного белка. Мол клетки Биол . (2000) 20: 4106–14. DOI: 10.1128 / mcb.20.11.4106-4114.2000

CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Cook PC, Owen H, Deaton AM, Borger JG, Brown SL, Clouaire T, et al. Доминирующая роль метил-CpG-связывающего белка Mbd2 в контроле индукции Th3 дендритными клетками. Нац Коммуна . (2015) 6: 1–11. DOI: 10.1038 / ncomms7920

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Шридде А., Бейн С.С., Майер Дж. У., Монтгомери Дж., Поллет Е., Денеке Б. и др. Тканеспецифическая дифференцировка макрофагов толстой кишки требует передачи сигналов, опосредованной рецептором TGFβ. Иммунол слизистой оболочки . (2017) 10: 1387–99. DOI: 10.1038 / mi.2016.142

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Уэбб Л.М., Ланди Р.Дж., Боргер Дж. Г., Браун С.Л., Коннор Л.М., Картрайт А.Н. и др.Интерферон типа I необходим для индукции Т-хелпера (Th) 2 дендритными клетками. EMBO J . (2017) 36: 2404–18. DOI: 10.15252 / embj.201695345

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Роведатти Л., Кудо Т., Бьянчери П., Сарра М., Ноулз С.Х., Рэмптон Д.С. и др. Дифференциальная регуляция выработки интерлейкина 17 и интерферона при воспалительном заболевании кишечника. Кишечник (2009) 58: 1629–36. DOI: 10.1136 / gut.2009.182170

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29.Gomollón F, Dignass A, Annese V, Tilg H, Van Assche G, Lindsay JO и др. 3-й европейский научно-обоснованный консенсус по диагностике и лечению болезни Крона 2016: часть 1: диагностика и лечение. J Crohn Colitis (2017) 11: 3–25. DOI: 10.1093 / ecco-jcc / jjw168

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Моват К., Коул А., Виндзор А., Ахмад Т., Арнотт И., Дрисколл Р. и др. Рекомендации по лечению воспалительных заболеваний кишечника у взрослых. Кишечник (2011) 60: 571–607. DOI: 10.1136 / gut.2010.224154

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Болдинг Дж., Ливингстон В. Дж., Конрой Дж., Майнетт-Джонсон Л., Вейр Д. Г., Махмуд Н. и др. Воспалительное заболевание кишечника: роль полиморфизма гена воспалительных цитокинов. Медиаторы воспаления . (2004) 13: 181–7. DOI: 10.1080 / 095110001713529

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Окаясу И., Хатакеяма С., Ямада М., Окуса Т., Инагаки Ю., Накая Р.Новый метод индукции экспериментального острого и хронического язвенного колита у мышей. Гастроэнтерология (1990) 98: 694–702.

PubMed Аннотация | Google Scholar

33. Купер Х.С., Мурти С.Н., Шах Р.С., Седергран Диджей. Клинико-патологическое исследование экспериментального мышиного колита декстрансульфата натрия. Лаборатория Инвест . (1993) 69: 238–49.

PubMed Аннотация | Google Scholar

34. Дилеман Л.А., Ридван БУ, Теннисон Г.С., Бигли К.В., Бьюси Р.П., Элсон, Колорадо.Колит, вызванный декстрансульфатом натрия, встречается у мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом. Гастроэнтерология (1994) 107: 1643–52.

PubMed Аннотация | Google Scholar

35. Абе К., Нгуен К.П., Файн С.Д., Мо Дж. Х., Шен С., Шенуда С. и др. Обычные дендритные клетки регулируют исход воспаления толстой кишки независимо от Т-клеток. PNAS (2007) 104: 17022–7. DOI: 10.1073 / pnas.0708469104

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36.Берндт Б.Э, Чжан М., Чен Г.Х., Хаффнагл, Великобритания, Као Дж. Роль дендритных клеток в развитии острого декстрансульфатно-натриевого колита. Дж Иммунол . (2007) 179: 6255–62. DOI: 10.4049 / jimmunol.179.9.6255

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Kwon KH, Murakami A, Hayashi R, Ohigashi H. Интерлейкин-1β нацелен на интерлейкин-6 при прогрессировании экспериментального колита, индуцированного декстрансульфатом натрия. Biochem Biophys Res Commun . (2005) 337: 647–54.DOI: 10.1016 / j.bbrc.2005.09.107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Со Су, Куффа П., Китамото С., Нагао-Китамото Х., Руссо Дж., Ким Ю.Г. и др. Кишечные макрофаги, возникающие из моноцитов CCR2 + , контролируют инфекцию патогена, активируя врожденные лимфоидные клетки. Нац Коммуна . (2015) 6: 8010. DOI: 10.1038 / ncomms9010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Ши К., Джиа Т., Мендес-Феррер С., Холь Т.М., Сербина Н.В., Липума Л. и др.Мезенхимальные стволовые клетки и клетки-предшественники костного мозга вызывают эмиграцию моноцитов в ответ на циркулирующие лиганды толл-подобных рецепторов. Иммунитет (2011) 34: 590–601. DOI: 10.1016 / j.immuni.2011.02.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Askenase MH, Han SJ, Byrd AL, Morais da Fonseca D, Bouladoux N, Wilhelm C, et al. Резидентные в костном мозге NK-клетки прививают моноцитам регуляторную функцию во время инфекции. Иммунитет (2015) 42: 1130–42.DOI: 10.1016 / j.immuni.2015.05.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Саниабади А.Р., Танака Т., Омори Т., Савада К., Ямамото Т., Ханаи Х. Лечение воспалительного заболевания кишечника адсорбционным лейкоцитаферезом: желание лечить без лекарств. WJG (2014) 20: 9699–18. DOI: 10.3748 / wjg.v20.i29.9699

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Дунай И.Р., Фукс А., Сибли Л.Д. Воспалительные моноциты, но не нейтрофилы, необходимы для борьбы с инфекцией Toxoplasma gondii у мышей. Заражение иммунной . (2010) 78: 1564–70. DOI: 10.1128 / IAI.00472-09

CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Stakenborg M, Goverse G, Farro G, Gomez-Pinilla PJ, Boeckxstaens GE, Matteoli G. Моноциты CCR2 необходимы для разрешения воспаления и восстановления тканей при колите. J Crohn Colitis (2016) 10 (Дополнение 1): S122.1 – S122. DOI: 10.1093 / ecco-jcc / jjw019.185

CrossRef Полный текст | Google Scholar

45. Имелински М., Бальдассано Р.Н., Гриффитс А., Рассел Р.К., Аннезе В., Дубинский М. и др.Общие варианты в пяти новых локусах, связанных с ранним началом воспалительного заболевания кишечника. Нат Генет . (2009) 41: 1335–40. DOI: 10,1038 / нг.489

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. Третон X, Педруцци Э., Казальс-Хатем Д., Гродет А., Панис Y, Гройер А. и др. Измененный стресс эндоплазматического ретикулума влияет на трансляцию в неактивной ткани толстой кишки пациентов с язвенным колитом. Гастроэнтерология (2011) 141: 1024–35. DOI: 10.1053 / j.гастро.2011.05.033

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Поддар Д., Басу А., Болдуин В.М., Кондратов Р.В., Барик С., Мазумдер Б. Экстрарибосомная функция рибосомного белка L13a в макрофагах устраняет воспаление. Дж Иммунол . (2013) 190: 3600–12. DOI: 10.4049 / jimmunol.1201933

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Поддар Д., Каур Р., Болдуин В.М., Мазумдер Б. L13a-зависимый контроль трансляции в макрофагах ограничивает патогенез колита. Клетка Мол Иммунол . (2016) 13: 816–27. DOI: 10,1038 / cmi.2015.53

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Llanos S, Serrano M. Истощение рибосомного белка L37 происходит в ответ на повреждение ДНК и активирует p53 через путь L11 / MDM2. Cell Cycle (2014) 9: 4005–12. DOI: 10.4161 / cc.9.19.13299

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Ueta M, Wada C, Bessho Y, Maeda M, Wada A.Рибосомный белок L31 в Escherichia coli способствует ассоциации и трансляции субъединиц рибосомы, тогда как короткий L31, расщепленный протеазой 7, снижает обе активности. Гены клеток (2017) 22: 452–71. DOI: 10.1111 / gtc.12488

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Маруяма Ю., Миядзаки Т., Икеда К., Окумура Т., Сато В., Хори-Иноуэ К. и др. Функциональный скрининг на основе библиотеки коротких шпилечных РНК выявил рибосомный белок L31, который модулирует рост клеток рака простаты посредством пути p53. PLoS ONE (2014) 9: e108743–10. DOI: 10.1371 / journal.pone.0108743

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

52. Уодделл А., Аренс Р., Стейнбрехер К., Донован Б., Ротенберг М.Э., Мюнниц А. и др. Эозинофильное воспаление толстой кишки при экспериментальном колите опосредуется Ly6Chigh CCR2 + , происходящим из воспалительных моноцитов / макрофагов CCL11. Дж Иммунол . (2011) 186: 5993–6003. DOI: 10.4049 / jimmunol.1003844

CrossRef Полный текст | Google Scholar

53.Такада Ю., Хисамацу Т., Камада Н., Китадзуме М. Т., Хонда Н., Осима Ю. и др. Хемоаттрактантный белок-1 моноцитов способствует гомеостазу кишечника и воспалению кишечника за счет состава субпопуляции регуляторных макрофагов, продуцирующих IL-10. Дж Иммунол . (2010) 184: 2671–6. DOI: 10.4049 / jimmunol.0804012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

54. Шультесс Дж., Мересс Б., Рамиро-Пуч Е., Монкуке Н., Дарше С., Бег Б. и др. Интерлейкин-15-зависимые врожденные лимфоидные клетки NKp46 + контролируют воспаление кишечника путем привлечения воспалительных моноцитов. Иммунитет (2012) 37: 108–21. DOI: 10.1016 / j.immuni.2012.05.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

55. Бэнкс С., Бейтман А., Пейн Р., Джонсон П., Шерон Н. Экспрессия хемокинов при ВЗК. Экспрессия хемокинов в слизистой оболочке неизбирательно повышается как при язвенном колите, так и при болезни Крона. Дж. Патол . (2002) 199: 28–35. DOI: 10.1002 / путь.1245

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Управление дефицитом витамина D при воспалительном заболевании кишечника

Введение

Пациенты с воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК, т. Е. Язвенный колит и болезнь Крона) подвержены риску развития внекишечных проявлений, таких как остеопения и остеопороз, из-за нескольких факторов, включая дефицит витамина D. .1 Однако, помимо классического воздействия на минерализацию костей, витамин D также обладает различными иммунологическими функциями, влияющими на пролиферацию и дифференцировку клеток, иммуномодуляцию и микробиом кишечника, и в последнее время его дефицит был вовлечен в развитие анемии хронического заболевания2–4. Исследования in vitro выявили ряд механизмов, с помощью которых биологически активная форма витамина D, 1,25 (OH) 2 D, может уменьшать воспаление.5 Например, лечение 1,25 (OH) 2 D подавляет ядерный фактор, усилитель легкой цепи каппа пути активированных В-клеток (NF-κB), тем самым снижая последующую экспрессию провоспалительных цитокинов, 6 и действуя как активируемый лигандом фактор транскрипции, рецептор витамина D (VDR) напрямую регулирует ген цитокина выражение.7

Эти наблюдения способствовали возникновению огромного интереса к возможному патогенному влиянию витамина D на клиническое течение ВЗК, особенно в связи с растущим объемом данных, свидетельствующих о том, что высокие концентрации циркулирующих провоспалительных биомаркеров, например интерлейкина-6, некроз опухоли фактор (TNF) -α и C-реактивный белок (CRP) связаны с дефицитом витамина D8, и что уровни противовоспалительных цитокинов снижаются в течение лета в связи с повышенными уровнями -25 (OH) D в сыворотке крови.9 Более того, дефицит витамина D чаще встречается при ВЗК по сравнению с населением в целом, особенно при болезни Крона.

В соответствии с этими знаниями, было проведено несколько клинических исследований, связывающих уровни витамина D со значимыми клиническими исходами при ВЗК.11–13 Независимо от других переменных, более низкие уровни витамина D связаны с более высоким риском клинического рецидива.13–15 Витамин D недостаточность может увеличить риск обострения ВЗК, поскольку это отрицательный модулятор провоспалительных каскадов, вызывающих дефекты кишечного эпителиального барьера, усиление иммунного ответа и разрушение кишечника.16

Целью данной статьи является обобщение имеющихся данных, а также предложение практических рекомендаций, основанных на недавних клинических исследованиях, о том, как управлять дефицитом витамина D у пациентов с ВЗК в клинических условиях.

Механизмы действия витамина D

Витамин D – жирорастворимый секостероидный гормон, выполняющий эндокринную и аутокринную функции. Основная эндокринная функция витамина D – поддержание гомеостаза кальция и метаболизма костей. Аутокринная функция витамина D зависит от генетической транскрипции, уникальной для того типа клеток, которые экспрессируют рецептор витамина D (VDR).Одним из таких аутокринных эффектов является модуляция воспалительных путей, которая играет роль при нескольких заболеваниях, включая ВЗК.

Сывороточные уровни 25 (OH) D используются для определения дефицита витамина D и считаются лучшим индикатором запасов витамина D в организме. Пороговые значения для уровней «дефицита» в основном основаны на физиологических уровнях, необходимых для предотвращения повышенных уровней. гормона паращитовидной железы и для поддержания здоровья костей, и даже они остаются спорным вопросом в научной литературе.3 Некоторые рекомендации экспертов, включая заявление Эндокринологического общества, рассматривают уровни s-25 (OH) D ниже 50 нмоль / л (т.е. 20 нг / мл) как дефицит и уровни в диапазоне 50–75 нмоль / л ( 20-30 нг / мл) как недостаточность.17 Однако Институт медицины США (ныне Национальная академия медицины) определяет дефицит как уровень s-25 (OH) D ниже 30 нмоль / л (12 нг / мл) и недостаточность, поскольку уровни 25 (OH) D находятся в диапазоне 30–50 нмоль / л (12–20 нг / мл) .3 18 Это пороговое значение, однако, основано на популяционных исследованиях в США, ориентированных на здоровье костей. , и было высказано предположение, что иммуномодулирующие и другие не-скелетные эффекты выигрывают от даже более высоких концентраций (например, 75 нмоль / л).17

Клинические исследования влияния витамина D на естественное течение ВЗК

Несколько исследований добавок витамина D подтвердили положительный эффект витамина D при ВЗК. В когорте исследования здоровья медсестер из 72 719 человек женщины с прогнозируемым наивысшим уровнем витамина D имели значительно более низкий риск развития болезни Крона.11 Более того, перекрестное исследование показало обратную связь между s-25 (OH) D. и активность заболевания у 182 пациентов с болезнью Крона, 19 как пациенты с нездоровой болезнью, имели значительно более высокие медианные уровни s-25 (OH) D, чем у пациентов с активной болезнью.Кроме того, в исследовании случай-контроль у пациентов с ВЗК изучалась биопсия толстой кишки с использованием иммуногистохимии, показывающая снижение экспрессии VDR в областях с высокими гистологическими признаками воспаления.

Чтобы ответить на вопрос о причинно-следственной связи, проспективное исследование 70 пациентов с язвенным колитом в клинической ремиссии, наблюдавшееся в течение 1 года, показало, что уровень s-25 (OH) D ниже 87,5 нмоль / л был связан с повышенным риском обострения болезни. 21 Аналогичным образом, проспективное 5-летнее продольное исследование с участием 965 пациентов с ВЗК обнаружило связь между витамином D и исходом, связанным со здоровьем.13 Низкие (т.е. <75 нмоль / л) уровни 25 (OH) D контролировались у 30% пациентов при входе в исследование13 и во время последующего наблюдения, и этим пациентам требовалось значительно больше лекарств (глюкокортикоидов, биологических и наркотических средств), CT сканирование, госпитализация и хирургическое вмешательство, чем у пациентов с уровнем 25 (OH) D ≥75 нмоль / л. 13 Для дальнейшего контроля влияния тяжести заболевания на уровни 25 (OH) D был проведен анализ подгрупп пациентов с клинической ремиссией на момент включения в исследование. В этой группе большему количеству пациентов с низким по сравнению с нормальным уровнем 25 (OH) D потребовались глюкокортикоиды (51% и 37% соответственно) или хирургическое вмешательство, связанное с ВЗК (34% и 22% соответственно).13 Более того, среди пациентов с низким уровнем витамина D, которые получали добавки витамина D, в течение 5-летнего периода наблюдения наблюдалось прогрессивное снижение обращения за медицинской помощью, в то время как пациенты с низким уровнем 25 (OH) D без каких-либо таких добавок, напротив, увеличивали свое медицинское обслуживание. утилизация. Это обширное исследование с обширной когортой ВЗК связывало низкий s-25 (OH) D с множеством исходов и добавило существенную информацию к растущему количеству доказательств между уровнями 25 (OH) D и исходами при ВЗК.15 Наконец, другое комплексное проспективное исследование 3217 пациентов с ВЗК также показало, что низкий уровень 25 (OH) D (т.е. <50 нмоль / л) был связан с более высоким риском хирургических вмешательств и госпитализаций, связанных с ВЗК, и что пациенты с болезнью Крона, которые нормализовал уровень 25 (OH) D, в то же время снизил риск хирургического вмешательства, связанного с ВЗК.

Реакция на биологические препараты

Лишь в нескольких исследованиях изучалась взаимосвязь между уровнями 25 (OH) D и вероятностью ремиссии при приеме определенных лекарств.Однако среди 37 пациентов с болезнью Крона быстрое увеличение s-25 (OH) D наблюдалось у лиц, реагирующих на ингибиторы TNF, 22 и недавно аналогичные наблюдения были отмечены и при язвенном колите.23 Более того, одноцентровая когорта исследование 101 пациента с ВЗК показало, что уровни 25 (OH) D до лечения влияли на стойкость ингибиторов ФНО.24 Это исследование подтвердило актуальность как коррекции, так и поддержания адекватных уровней витамина D при ВЗК ≥75 нмоль / л для снижения риска обострений. и оптимизировать ответ на целевые медицинские схемы.24 Наконец, ретроспективное исследование 384 пациентов с ВЗК, получавших биопрепараты, пришло к выводу, что пациенты с ВЗК с нормальным уровнем s-25 (OH) D в начале лечения ингибитором ФНО имели в 2,6 раза больше шансов достичь ремиссии в течение 3 месяцев. по сравнению с пациентами с низкой концентрацией витамина D.23 Тем не менее, канадское проспективное рандомизированное контролируемое клиническое исследование (РКИ) с участием 28 пациентов с болезнью Крона от умеренной до тяжелой степени, запланированное для инфликсимаба, разделило пациентов на пациентов с низкой концентрацией (т. е. <75 нмоль / L) или нормальный уровень s-25 (OH) D.25 Пациенты получали индукционную терапию инфликсимабом, и на 14-й неделе пациентам с дефицитом витамина D вводили внутримышечный холекальциферол и повторно оценивали на 22-й неделе. Неожиданно это исследование показало, что пациенты с низким уровнем витамина D имели более высокую скорость клинической ремиссии. чем у пациентов с нормальным уровнем как на 14-й, так и на 22-й неделе (80% против 23% (p = 0,007) и 79% против 17% (p = 0,005), соответственно) .25 Нет очевидного объяснения этому результату, подчеркивая, что до сих пор остаются неясными механистические проблемы, связанные с витамином D при ВЗК.25

Витамин D как средство лечения ВЗК

Экспериментальные исследования на мышах ранее показали, что витамин D снижает тяжесть колита.26 У людей дефицит витамина D или нарушение передачи сигналов VDR могут усугубить колит из-за множества эффектов 27 и приема добавок витамина D. сообщалось, что он увеличивает как бактериальное богатство, так и разнообразие в пользу микробиоты, продуцирующей бутират28 (рисунок 1).

Рисунок 1

Эпителиальные механизмы витамина D: (1) показано, что повышенная активность VDR подавляет NF-κB-зависимые эпителиальные пути апоптоза при экспериментальном колите.(2) Клаудин-2 (CL-2), параклеточный катионный канал, участвующий в формировании барьера, по-видимому, зависит от витамина D, хотя точный механизм требует дальнейшего раскрытия. Повышенная экспрессия CL-2 наблюдается в воспаленном кишечнике, который, в свою очередь, подавляется лечением 1,25 (OH) 2 D. Низкий s-1,25 (OH) 2 D у пациентов с ВЗК. связан со сниженной экспрессией zonula occludens 1 (белок плотных контактов) и E-cadherin (компонент соединения адгеринов).Более того, caco-2, линия клеток колоректального рака, активирует белки плотных контактов при стимуляции 1,25 (OH) 2 D. (3) Обработка бактериального продукта бутиратом в линиях клеток толстой кишки человека значительно увеличивает экспрессию VDR. (4) Секреция связанного с катилицидином антимикробного пептида (цАМФ) и других АМП, таких как α-дефенсины из клеток Панета подвздошной кишки и β-дефенсины из колоноцитов, по-видимому, являются ключевыми факторами в регуляции микробиоты. Известно, что VDR увеличивает экспрессию АМФ, а также сводит на нет подавление экспрессии цАМФ, вызванное патогенами.Отсутствие VDR также влияет на функцию лизосом и аутофагию в эпителии кишечника, что означает роль VDR в регуляции микробов. (5) VDR играет роль в антигенпредставляющей функции дендритных клеток и, таким образом, в модуляции их иммунологического ответа. Активация VDR приводит к снижению соотношений IL-10 / IL-12, что способствует созреванию регуляторных Т-клеток и тем самым снижает провоспалительный ответ. ВЗК, воспалительное заболевание кишечника; ИЛ, интерлейкин.

Тем не менее, лишь в нескольких РКИ изучалось влияние добавок витамина D на исход ВЗК.В небольшом исследовании болезни Крона в стадии ремиссии 94 пациента были рандомизированы для приема 1200 МЕ витамина D3 в день или аналогичного плацебо. Исследование пришло к выводу, что прием добавок в течение 12 месяцев незначительно повысил уровни s-25 (OH) D и незначительно (p = 0,06) снизил долю пациентов с клиническим рецидивом с 29% до 13% .29

Однако добавление ко всем пациентам одинакового количества витамина D может привести к тому, что пациенты с низким базальным уровнем не достигнут терапевтического порога.Тем не менее, это не имело отношения к интервенционному исследованию с участием 18 пациентов с болезнью Крона30, которые применили дизайн, ориентированный на достижение уровня 25 (OH) D 100 нмоль / л вместо получения фиксированной суточной дозы витамина D. Через 6 месяцев, авторы сообщили о весьма значительном снижении показателей активности заболевания. К сожалению, это исследование имело определенные недостатки, в том числе очень небольшую когорту исследования и отсутствие контрольной группы30.

В рандомизированном контролируемом исследовании с участием 90 пациентов с нездоровым язвенным колитом31 сравнивались эффекты однократной внутримышечной инъекции очень высокой дозы витамина D (300 000 МЕ) с внутримышечной инъекцией 1 мл физиологического раствора (плацебо).Системное воспаление, измеряемое как уровень сывороточного СРБ, оценивалось через 3 месяца после вмешательства, показывая снижение в группе, получавшей витамин D3.31

Для решения некоторых проблем с недостаточной дозировкой витамина D в различных исследованиях в недавнем проспективном пилотном исследовании 10 пациентов с активной ВЗК и уровнем s-25 (OH) D <75 нмоль / л использовались пероральные дозы 5000. –10 000 Ед / сут. Корректировку дозы проводили 4 раза в неделю с целью достижения целевого уровня 100–126 нмоль / л. Пероральные дозы, использованные в протоколе, составляли 5000–10 000 Ед / день.За 12 недель исследования среднее увеличение составило 50 нмоль / л (20 нг / мл), при этом большинству пациентов потребовалось по крайней мере один 4-недельный период приема 10 000 ЕД / день. Целевой или почти целевой показатель был достигнут у всех участников в течение 12 недель, и, хотя сигнал о гиперкальциурии был отмечен у одного пациента, режим хорошо переносился, и показатели активности на основе симптомов улучшились.

В недавнем проспективном исследовании оценивали субъективные и объективные маркеры кишечного воспаления, а также фекальную микробиоту после замены витамина D у пациентов с активным и неактивным язвенным колитом и в контрольной группе без ВЗК.33 Дефицит витамина D определялся как 25 (OH) D <50 нмоль / л. Участвовали двадцать пять человек (восемь с активным заболеванием, девять с незаметным заболеванием, а также восемь контрольных лиц без ВЗК). Исследование впервые показало, что замена 40000 МЕ витамина D 3 один раз в неделю в течение 8 недель у пациентов с активным язвенным колитом улучшила объективные маркеры воспаления, включая калпротектин, количество тромбоцитов, альбумин, а также показатели активности заболевания. Однако общее разнообразие микробиоты не изменилось, что позволяет предположить, что витамин D снижает воспаление кишечника независимо от бактериального состава фекалий.33

Несмотря на то, что доступные исследования имеют затруднения или ограничения (например, вариации в пороговых уровнях значений s-25 (OH) D, используемых для определения “ дефицита ”; различия в группах исследований и дизайнах, включая критерии включения и исключения, а также применяемые оценки активности; лечебные дозы; и исходы), и поскольку прямые сравнения между исследованиями осложняются отсутствием стандартизации между различными анализами, используемыми для измерения уровней 25 (OH) D 27, они, по-видимому, поддерживают концепцию витамина D, обладающего анти- воспалительные эффекты при ВЗК.12 14

Практический подход к добавлению витамина D для пациентов с ВЗК в клинических условиях

При выборе правильной стратегии приема добавок витамина D при ВЗК необходимо учитывать несколько факторов, включая активность заболевания, степень дефицита, мальабсорбцию, ожирение, комплаентность и солнце -выявительные привычки.

Уровни витамина D тесно связаны с активностью ВЗК. и их объединение, вероятно, представляет собой динамический процесс. Уровни витамина D непропорционально низкие среди пациентов с ВЗК с активным воспалением.34 Низкий уровень витамина D может увеличить риск будущего клинического рецидива ВЗК, 13 24 при лечении обострения ВЗК приводит к повышению уровня витамина D. Таким образом, важно сначала рассмотреть активность заболевания пациента с ВЗК, прежде чем составлять план для оптимизации уровня витамина D. Учитывая, что пациенты с ВЗК с обострениями заболевания имеют высокий риск развития мальабсорбции и дефицита витамина D, мы предлагаем вводить более высокую начальную болюсную дозу и тестировать мальабсорбцию среди пациентов с ВЗК с активным заболеванием (рисунок 2).

Рисунок 2

Подход к добавлению 25 (OH) D у пациентов с ВЗК. Определение адекватной суточной дозы как (целевой уровень s-25 (OH) D – текущий уровень s-25 (OH) D) мкг. Если целевой уровень не достигается в течение 3 месяцев, следует попробовать еженедельное болюсное введение. Если текущий уровень остается ниже целевого уровня, следует учитывать мальабсорбцию. CRP, C-реактивный белок; HBI, индекс Харви Брэдшоу; ВЗК, воспалительное заболевание кишечника; UCDAI, Индекс активности язвенного колита.

Несмотря на то, что не существует «золотого стандарта» для адекватных уровней s-25 (OH) D при ВЗК, большинство данных предполагают, что уровень s-25 (OH) D> 75 нмоль / л полезен по сравнению с пациентами с ВЗК с s-25. (OH) D <50 нмоль / л с точки зрения уровня маркеров воспаления и клинических оценок.16

Симптоматическая интоксикация витамином D (вызывающая гиперкальциемию и кальцификаты почек) встречается очень редко и в большинстве случаев сообщается только у людей с уровнем s-25 (OH) D выше 4–500 нмоль / л. Однако повышенный риск нежелательных явлений, по-видимому, связан с уровнями s-25 (OH) D> 200 нмоль / л.27 Соответственно, исходя из наших текущих знаний, представляется разумным стремиться к достижению s-25 ( Уровень OH) D находится в диапазоне 75–125 нмоль / л.

С фармакокинетической точки зрения было показано, что ежедневное и еженедельное пероральное дозирование, а также введение витамина D в виде большой пероральной или внутримышечной болюсной дозы (с интервалом в несколько месяцев) эффективны для поддержания уровня s-25 (OH) D на высоком уровне. уровень.Однако, хотя внутримышечные болюсные инъекции, как правило, достигают того же уровня, что и равная общая пероральная доза, повышение уровней s-25 (OH) D происходит с задержкой на месяц после инъекционной терапии35. или внутримышечная болюсная доза, как было показано в РКИ, увеличивает риск падений и переломов.36 37 Как следствие, Целевая группа профилактических служб США, а также другие недавно призвали с осторожностью использовать добавки с высокими дозами витамина D. 38 39 Поэтому ежедневная доза витамина D является предпочтительным вариантом.

Как показывает практика, уровни s-25 (OH) D увеличиваются примерно на 1 нмоль / л на 1 мкг (40 МЕ) ежедневного приема витамина D340. Эффект относительно более выражен при недостаточности витамина D по сравнению с у людей с избытком витамина D, тогда как реакция снижается с увеличением массы тела.41 Более того, сравнивая две наиболее распространенные формы витамина D, эрго- (D2) и холекальциферол (D3), холекальциферол кажется более сильнодействующим, чем эргокальциферол, при добавлении в больших количествах. оральный болюс.41 год

Соответственно, суточная доза витамина D (в мкг), необходимая для получения уровня s-25 (OH) D в целевом диапазоне (например, 100 нмоль / л), может быть оценена как 100 минус измеренное s-25 ( ОН) Уровень D. Уровни 25 (OH) D в сыворотке крови следует повторно измерить через 3-4 месяца. Если не в целевом диапазоне и нельзя исключить несоблюдение режима, можно рассмотреть возможность рекомендовать еженедельный прием добавок витамина D в дозе, равной расчетной суточной дозе. Если все еще не в целевом диапазоне, можно провести тест абсорбции витамина D, предоставив пациенту пероральную большую дозу (например, 100 000–300 000 МЕ) витамина D.В ответ на такую ​​высокую дозу следует ожидать значительного повышения уровня s-25 (OH) D в течение 2–4 недель42. Чтобы обеспечить соблюдение режима, болюсная доза должна вводиться под наблюдением медицинского работника. . Если ответ достигается после большого перорального болюса, наиболее вероятным объяснением отсутствия эффекта от ежедневного / еженедельного дозирования является низкая комплаентность или относительная мальабсорбция. Если это так, суточная / недельная доза витамина D может быть увеличена (удвоена / утроена), чтобы определить, может ли это привести к достижению уровня s-25 (OH) D в пределах целевого диапазона.Тем не менее, если в ответ на большой болюс не достигается значительного повышения уровня s-25 (OH) D, следует учитывать серьезную мальабсорбцию. Соответственно, могут потребоваться внутримышечные инъекции витамина D, но это следует рассматривать как последний вариант. В качестве альтернативы можно рассматривать частое пребывание на солнце или использование шезлонгов. Пациенты должны быть полностью проинформированы о том, что каждый эпизод пребывания на солнце (в постели) должен длиться только в течение такого короткого времени из-за потенциально повышенного риска злокачественных новообразований кожи.Следует учитывать время года, поскольку доза витамина D, необходимая для поддержания уровня витамина D, может быть ниже в летнее время. По той же причине мы рекомендуем измерять уровень 25 (OH) D не реже одного раза в год (предпочтительно в зимнее время) и чаще в случае недостаточности и / или во время обострения заболевания (каждые 3–4 месяца).

Наши предложения по оптимизации уровней 25 (OH) D с помощью добавок у пациентов с ВЗК, однако, следует интерпретировать с осторожностью из-за отсутствия долгосрочных РКИ по влиянию добавок витамина D при ВЗК.

Выводы и рекомендации

До сих пор неясно, является ли дефицит витамина D причиной ВЗК. Однако дефицит витамина D, по-видимому, преобладает при ВЗК и обратно связан с активностью заболевания, более частыми рецидивами, более частыми послеоперационными рецидивами, более низким качеством жизни и в целом аномальной реакцией на биологические препараты по сравнению с пациентами с нормальным или высоким s- Уровни 25 (OH) D.16 Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования для определения оптимального терапевтического уровня 25 (OH) D при ВЗК (т. Е. Следует ли рекомендовать другие пороговые значения для экстраскелетных преимуществ) или должны ли быть введены другие параклинические тесты, такие как витамин D-связывающий белок и свободный и биодоступный витамин D, а также прояснить, как витамин D изменяет уровни воспаления и его точное влияние на тяжесть заболевания.Следует дополнительно оценить, существуют ли различия в метаболизме и абсорбции витамина D при ВЗК. Кроме того, вмешательства должны быть сосредоточены на уровнях витамина D в бессимптомные периоды, когда это возможно, чтобы избежать путаницы и исследования его потенциального синергизма с текущими и будущими методами лечения ВЗК.

В совокупности имеющиеся данные подтверждают, что витамин D, по-видимому, играет непосредственную роль в патогенезе ВЗК как на клеточном, так и на фенотипическом уровне, и его потенциальную роль в качестве терапевтического агента в улучшении болезненного состояния у этих пациентов, даже при наличии имеющихся знаний основано на косвенных доказательствах.Таким образом, неясно, будет ли когда-либо однозначно установлена ​​причинно-следственная связь, поскольку промышленные спонсоры могут быть заинтересованы в финансировании РКИ надлежащего размера по добавлению витамина D в когорте вмешательства с незапатентованным препаратом.

Как уже упоминалось, кажется разумным предлагать пациентам с ВЗК измерения уровней s-25 (OH) D не реже одного раза в год (предпочтительно зимой). Мы предоставили читателю блок-схему приема добавок витамина D с относительно недорогими и доступными лекарствами и последующими наблюдениями.Такие усилия могут повысить вероятность достижения клинической ремиссии ИБК и применения традиционных терапевтических стратегий и, таким образом, привести к лучшим результатам для пациентов, а также к сокращению расходов на здравоохранение.

Инозин, полученный из кишечной микробиоты из пищевых добавок из листьев ячменя, ослабляет колит за счет активации передачи сигналов PPARγ | Microbiome

Приготовление порошка BL

Порошок BL, использованный в этом исследовании, был сырым порошком без какого-либо процесса экстракции и был предоставлен Hebei Biotechnology Co., Ltd. (Цзясин, Китай). Вкратце, свежие листья Hordeum vulgare L. (выращенного в Ханчжоу, Китай) промывали водой, разрезали на кусочки и сушили в сублимационной сушилке OE-950 (Labor, MIM, Будапешт, Венгрия) при -60 ° C. на 24 ч. Высушенный BL измельчали ​​в смесителе (KA-2610, Jworld Tech, Корея) в течение 1 мин, просеивали через сито 300 меш и хранили при -20 ° C до использования. Ближайший анализ порошка BL был выполнен Pony Testing International Group (Пекин, Китай) ( Дополнительный файл 2: Таблица S1 ) .

Эксперименты на животных

Восьминедельные самки мышей C57Bl / 6J были получены от Vital River Laboratory Animal Technology (Пекин, Китай) и содержались в среде, свободной от специфических патогенов (SPF) с 12-часовым циклом света и темноты. . Всех мышей адаптировали к лабораторным условиям с неограниченным доступом к пище и воде в течение как минимум одной недели. Эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по экспериментам на животных Центра науки о здоровье Пекинского университета (Пекин, Китай), и протоколы были одобрены Комитетом по этике животных этого учреждения.Мышей распределяли случайным образом и кормили либо стандартной пищевой диетой (CD), либо изокалорийной диетой, в которой BL добавлялся в соотношении 2,5%, дозировка, переведенная из предыдущего исследования с участием человека [24]. Состав двух диет был указан в Дополнительном файле 2: Таблица S2 и подготовлен Hfk Biotech Co, Ltd (Пекин, Китай).

Для лечения антагонистом PPARγ GW9662 или антагонистом A 2A R SCH58261 мышам вводили 3 мг / кг / день GW9662 внутрижелудочно [19] или вводили 2 мг / кг / день SCH58261 внутрибрюшинно [32].

Для эксперимента с антибиотиками использовали комбинацию неомицина (100 мг / л), стрептомицина (50 мг / л), пенициллина (100 мг / л), ванкомицина (50 мг / л) и метронидазола (100 мг / л). вводится с питьевой водой.

Для лечения инозином мышей внутрижелудочно вводили 800 мг / кг / день инозина (Sigma-Aldrich), растворенного в PBS, в концентрации 40 мг / мл [32].

Колит, вызванный декстран-сульфатом натрия (DSS)

Колит был вызван введением 2.5% DSS (молекулярная масса 36 000–50 000 кДа; MP Biomedicals) растворяли в питьевой воде в течение 7 дней. Мышей ежедневно взвешивали и наблюдали за признаками консистенции стула и ректального кровотечения. Оценка индекса активности заболевания проводилась путем объединения параметров потери веса, консистенции стула и ректального кровотечения, как описано ранее [60]. Индекс активности заболевания представлял собой среднее значение суммарной оценки трех параметров. Мышей умерщвляли на 7 день и измеряли длину толстой кишки.

Оценка кишечной проницаемости

Вкратце, флуоресцеинизотиоцианат (FITC) -декстран (4 кДа; Sigma) растворяли в PBS в концентрации 100 мг / мл. После того, как мышей голодали в течение 4 часов и перорально вводили FITC-декстран (60 мг / 100 г массы тела). Кровь собирали еще через 4 часа и центрифугировали при 1000 об / мин в течение 20 минут. Сыворотку собирали и флуоресценцию определяли количественно при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны испускания 535 нм.

Секвенирование и анализ гена 16S рРНК

Тотальную ДНК экстрагировали из содержимого толстой кишки или образцов фекальной культуры с использованием мини-набора QIAamp-DNA Stool Mini (Qiagen, Hilden, Германия).Целостность экстрагированной ДНК проверяли электрофорезом в 1% (мас. / Об.) Агарозных гелях. На основании количества и качества экстрагированной ДНК были отобраны образцы для последующего секвенирования.

Образцы

ДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР-амплификации области V3 – V4 бактериальных генов 16S рРНК. ПЦР-амплификацию выполняли на системе ABI GeneAmp®9700 PCR (AppliedBiosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США), а продукты амплификации ПЦР количественно оценивали с помощью портативного флуориметра QuantiFluor TM -ST с УФ / синими каналами (Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин). , СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ).

Секвенирование продуктов ПЦР-амплификации выполняли на платформе Illumina Miseq в Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Вкратце, данные секвенирования гена 16S рРНК были отфильтрованы, обрезаны и далее классифицированы в операционные таксономические единицы (OTU) с разницей в 0,03 (эквивалент 97% сходства). Затем был создан репрезентативный набор последовательностей, которым была присвоена таксономия с использованием базы данных SILVA (Release115 http://www.arb-silva.de). Анализ кривых разрежения и расчет оценок богатства и индексов разнообразия проводился с помощью программы MOTHUR.Таксономическая структура сообщества и филогения были проанализированы посредством визуализации наборов данных о микробном разнообразии и численности различных образцов.

Анализ воспалительных цитокинов

Уровни цитокинов в сыворотке и тканях толстой кишки определяли с помощью набора для иммуноферментного анализа (ELISA) (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute Co., Ltd. Nanjing, Китай) в соответствии с инструкциями производителя.

Гистологическая оценка

Собранные образцы толстой кишки фиксировали в 4% параформальдегиде и заливали парафином.Залитые парафином ткани толстой кишки были разрезаны (толщиной 4 мкм) и подвергнуты окрашиванию гематоксилином и эозином (HE) и альциановым синим (AB) с использованием коммерческих наборов (Beijing Solarbio Technology Co., Ltd. Пекин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. инструкции. Высоту крипты и ширину мышечного слоя в толстой кишке измеряли с помощью ImageJ (Media Cybernetics, Inc., Роквилл, Мэриленд, США). Бокаловидные клетки, продуцирующие слизь, наблюдали и подсчитывали под световым микроскопом (Leica DM500).Случайным образом были выбраны шесть микроскопических полей каждого участка яичек.

Гистологическая патология оценивалась в соответствии с ранее установленной системой баллов, а именно: повреждение крипты (шкала 0–4), тяжесть воспаления (шкала 0–3) и глубина повреждения (шкала 0–3) [61].

Оценка перистальтики кишечника

Периодичность кишечника определяли путем оценки времени прохождения кишечника и частоты дефекации. После того, как мышей не голодали в течение 4 часов, отдельной мыши вводили через зонд 10 мкл / г 6% раствора кармина (в концентрации 0.5% метилцеллюлоза). Время от желудочного зондирования до начального появления кармина в фекалиях регистрировали как время прохождения через кишечник для данной мыши.

Частоту дефекации регистрировали путем разделения мышей в стерильную клетку, и кумулятивные фекальные гранулы в течение 60 минут регистрировали как соответствующее количество дефекаций для данной мыши.

Сканирующая электронная микроскопия

Ткани толстой кишки фиксировали 2,5% -ным разведением PBS глутаральдегидом. После трехкратной промывки в PBS образцы фиксировали в 1% тетроксиде осмия в течение 1 часа, обезвоживали в спирте и затем сушили до критической точки с использованием CO 2 .Образцы были покрыты золотом и исследованы в сканирующем электронном микроскопе Hitachi S-3400 (Hitachi, Япония).

Просвечивающая электронная микроскопия

Ткани толстой кишки фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом. PBS использовали для удаления излишков фиксатора. Затем образцы фиксировали 1% тетроксидом осмия при 4 ° C в течение 2 ч, обезвоживали в ацетоне. Наконец, образцы были пропитаны пропиленоксидом 1: 1 и смолой EPON в течение 1 часа с последующей инфильтрацией в течение ночи в 100% смоле EPON. Ткани помещали в плоские формы в 100% EPON на 36 часов при 60 ° C.Ультратонкие срезы размером 70 нм окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца (по 10 мин каждый) и просматривали под просвечивающим электронным микроскопом H-7650 (Hitachi, Япония).

Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция

После депарафинизации и регидратации срезы толстой кишки блокировали 5% бычьим сывороточным альбумином в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем промывали PBS. Срезы тканей инкубировали с первичным антителом Muc-2 (Santa Cruz, sc-515032), Ly6G (Abcam, ab25377) и F4 / 80 (Abcam, ab6640) в течение ночи при 4 ° C.Предметные стекла трижды промывали PBS перед нанесением вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой (Invitrogen), на 2 часа при комнатной температуре.

Для иммунофлуоресцентного окрашивания залитые парафином срезы или клетки толстой кишки инкубировали с первичным антителом PPARγ (Abcam, ab59256) при 4 ° C в течение ночи. На следующий день использовали вторичное антитело осла против кролика Alexa Fluor488 (Invitrogen).

Количественная ПЦР в реальном времени

Суммарную РНК тканей толстой кишки выделяли с использованием реагента ТРИЗОЛ (Invitrogen, США).Количество и чистоту РНК оценивали по поглощению при 260 нм и 280 нм. Обратную транскрипцию 10 мкл РНК проводили с использованием PrimeScript RT Master Kit (Takara, Japan). Экспрессию генов измеряли в одноцветной системе обнаружения ПЦР в реальном времени MyiQ (Bio-Rad) с набором SYBR Real-time PCR Kit (Takara, Япония). GAPDH использовали в качестве эндогенного контроля. Средние значения Ct из трех анализов нормализовали по средним значениям Ct GAPDH. Последовательности праймеров описаны и синтезированы Sunbiotech Co.(Пекин, Китай) ( Дополнительный файл 2: Таблица S3 ) .

Секвенирование РНК.

Ткани толстой кишки собирали и общую РНК экстрагировали с использованием реагента ТРИЗОЛ (Invitrogen, США). Качество РНК оценивали электрофорезом с использованием биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies, Сан-Диего, Калифорния, США). Образцы с числами целостности РНК (RIN)> 9,4 и с коэффициентами поглощения 260/280 нм от 1,9 до 2,1 использовали для создания библиотек RNA-Seq.Библиотеки были сконструированы с использованием набора TruSeq ™ RNA Sample Prep (Illumina, San Diego, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя.

Секвенирование библиотек выполняли на приборе Illumina HiSeq2000 от Shanghai Majorbio Biopharm Biotechnology (Шанхай, Китай) и индивидуально оценивали качество с помощью FastQC. Анализ дифференциальной экспрессии проводился с помощью DESeq2 [62]. Статистическая значимость оценивалась с использованием отрицательного биномиального критерия Вальда, затем корректировалась для проверки множественных гипотез с помощью метода Бенджамини-Хохберга.Кластерный анализ функционального обогащения был выполнен для анализа пути обогащения Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG).

Ненаправленная метаболомика

Метаболомика на основе газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) была выполнена компанией ProfLeader Biotech (Шанхай, Китай). Вкратце, образцы сыворотки отделяли от крови центрифугированием и хранили при -80 ° C. Содержимое толстой кишки или образцы ткани толстой кишки, смешанные с водой, встряхивали перед центрифугированием. Супернатант переносили во флакон для ГХ, содержащий внутренние стандарты.Смесь сушили в слабом потоке азота и затем добавляли гидрохлорид метоксиамина в пиридине. Полученную смесь интенсивно встряхивали и инкубировали при 37 ° C в течение 90 мин. Дериватизацию проводили путем добавления в смесь BSTFA (с 1% TMCS). Дериватизированные образцы анализировали с помощью системы газовой хроматографии Agilent 7890A, соединенной с инертной системой MSD Agilent 5975C (Agilent Technologies, Калифорния, США). Для разделения производных использовали капиллярную колонку с плавленым кремнеземом HP-5MS.Гелий использовался в качестве газа-носителя при постоянной скорости потока через колонку. Образцы анализировали в случайной последовательности.

Полученные данные ГХ / МС были импортированы в SIMCA Statistical Analysis (версия 13.0, Umetrics AB, Умео, Швеция), где проводился многомерный статистический анализ, включая анализ главных компонентов (PCA) и частичный дискриминантный анализ методом наименьших квадратов (PLS-DA). выполнила. Дифференциальные метаболиты определялись сочетанием важности переменной в прогнозном значении (VIP) (> 1) модели PLS-DA и значений P (<0.05) из двустороннего теста Стьюдента t на нормированные интенсивности пиков. Изменение кратности рассчитывали как двоичный логарифм среднего нормализованного отношения площадей пиков между двумя группами. Структурную идентификацию дифференциальных метаболитов проводили с использованием программного обеспечения AMDIS, где очищенные масс-спектры автоматически сопоставлялись с внутренней стандартной библиотекой, включая время удерживания и масс-спектры, библиотеку Agilent Fiehn GC / MS Metabolomics RTL и базу данных Golm Metabolome соответственно.

Количественный анализ метаболитов пурина

Образцы сыворотки, содержимого толстой кишки или фекальных культур смешивали с дистиллированной водой, содержащей внутренний стандарт (4-аминосалициловую кислоту). Смесь экстрагировали этилацетатом. После центрифугирования верхний слой переносили и упаривали досуха в токе азота. Сухой остаток восстанавливали в ацетонитриле и BSTFA (с 1% TMCS) и дериватизировали для проведения анализа GC-MS. Для количественного определения готовили смешанный стандартный раствор, содержащий исходные стандартные растворы инозина и гуанозина в концентрации 100 мкг / мл.

Анаэробное культивирование in vitro

Свежие фекалии мышей (0,5 г) 8-недельных мышей-самцов C57Bl / 6 ресуспендировали в 10 мл стерильного PBS и совместно культивировали с порошком BL с конечной концентрацией 10 мг / мл ниже анаэробные условия (10% H 2 , 10% CO 2 , 80% N 2 ). После инкубации в течение 12 и 24 часов культивированные образцы собирали и использовали для обнаружения метаболитов и анализа бактериального состава.

Культура клеток и обработка

Клеточные линии эпителиальной карциномы толстой кишки человека HT29 и Caco2 были приобретены из Американской коллекции типовых культур (АТСС).Клетки поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина в увлажненном инкубаторе (5% CO 2 , 95% воздуха, 37 ° C). Клетки выращивали до 80-90% слияния и обрабатывали в течение указанных периодов времени инозином (Sigma-Aldrich) и гуанозином (Sigma-Aldrich) из исходного раствора в PBS до конечной концентрации 0,5, 1, 2 и 4 мМ. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью набора для анализа жизнеспособности клеток Cell Counting Kit (CCK) -8 от GenMed Inc.(Шанхай, Китай) согласно инструкции производителя.

Анализ репортерной люциферазы

Плазмидный вектор PPARγ-люциферазы был приобретен у RiboBio Co., Ltd (Гуанчжоу, Китай). Клетки HT29 временно трансфицировали с использованием реагента липофектамин 3000 (ThermoFisher Scientific). Вкратце, 1 × 10 5 клеток высевали на 6-луночные планшеты и выращивали в течение 24 часов. Комплекс для трансфекции, содержащий 1 мкг плазмидной ДНК и реагент для трансфекции, добавляли в каждую лунку в отсутствие FBS.Через 6 часов добавляли среду, содержащую 10% FBS, и клетки обрабатывали инозином и гуанозином (0,5, 1, 2 и 4 мМ) в течение 24 часов. Активность люциферазы измеряли с помощью системы анализа люциферазы (Promega) с использованием люминометра (Perkin Elmer, Covina, CA).

Вестерн-блот-анализ

Клетки лизировали лизисным буфером с 1% смесью ингибиторов протеазы для сбора общего клеточного белка. Концентрацию экстрагированного белка определяли количественно с помощью набора для анализа белков бицинхониновой кислоты (BCA) (Beyotime).Равное количество образца белка наносили на гель для электрофореза додецилсульфат-полиакриламидного геля и затем переносили на поливинилидендифторидную мембрану (Millipore, Billerica, MA, USA). После блокирования мембраны обезжиренным молоком ее инкубировали с первичными антителами против Muc2 (Santa Cruz, sc-515032), PPARγ (Abcam, ab59256), A 2A R (Abcam, ab3461) и GAPDH (Abcam, ab8245 ). На следующий день в течение 2–3 часов зондировали вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена.Сигналы белков детектировали с помощью реагента с усиленной хемилюминесценцией ECL в соответствии с инструкциями производителя.

Малая интерферирующая РНК

siRNA против PPARγ или A 2A R была приобретена у GenePharma (Шанхай, Китай). Для экспериментов по нокдауну 1 × 10 5 клеток HT29 и Caco2 помещали в 6-луночные планшеты и выращивали в течение 24 часов. PPARγ, A 2A R или контрольную миРНК трансфицировали в клетки с использованием реагента липофектамин 3000 (ThermoFisher Scientific).Через 24 часа трансфекций клетки индуцировали инозином (0, 2 и 4 мМ) в течение 24 часов. Затем клетки лизировали с использованием буфера RIPA, и экспрессию белка A 2A R, PPARγ или Muc2 определяли с помощью вестерн-блоттинга.

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием Prism 6.0 (GraphPad Software, CA). Данные представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего. Значительные различия между двумя группами оценивали с помощью двустороннего непарного теста Стьюдента t .Значимые различия в более чем двух группах оценивали с помощью однофакторного или двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественных сравнений Тьюки.

При анализе данных секвенирования кишечной микробиоты был проведен двусторонний тест суммы рангов Вилкоксона от R Project. При анализе различий в распределении обилия среди метаболитов был проведен тест Манна-Уитни U с коррекцией ложной скорости обнаружения по Бенджамини-Хохбергу. Различия считались достоверными при P <0.05.

Прекращение взаимодействия интегрина EMILIN1-β1 способствует экспериментальному колиту и канцерогенезу толстой кишки

Основные моменты

EMILIN-1 / β 1 Взаимодействие интегринов оказывает онкосупрессивную роль в микросреде толстой кишки 8

Потеря экспрессии EMILIN-1 влияет на разрешение воспаления в CAC

Недостаток EMILIN-1 вызывает формирование аберрантного лимфангиогенеза, приводящего к нефункциональным лимфатическим сосудам

Abstract

Рак толстой кишки является одним из первые типы опухолей, в которых описана функциональная связь между воспалением и возникновением опухоли; однако сигналы микросреды, влияющие на прогрессирование рака толстой кишки, плохо изучены.Здесь мы демонстрируем, что экспрессия молекулы ЕСМ EMILIN-1 останавливает развитие опухолей, индуцированных AOM-DSS. Фактически, после обработки AOM-DSS мыши Emilin1 – / – ( E1 – / – ) характеризовались более высокой заболеваемостью опухолями, более крупными аденомами и меньшей выживаемостью. Аналогичные результаты были получены с моделью трансгенной мыши E933A EMILIN-1 (E1-E933A), экспрессирующей мутантный EMILIN-1, неспособный взаимодействовать с интегринами α4 / α9β1.Интересно, что при хроническом лечении DSS мыши E1 – / – и E1-E933A характеризовались наличием повышенных воспалительных инфильтратов, более высокими показателями колита и более серьезными повреждениями слизистой оболочки по сравнению с диким типом ( E1 + / + ) мышей. Поскольку изменения лимфатической сети кишечника являются хорошо изученным признаком воспалительного заболевания кишечника человека, а ЭМИЛИН-1 является ключевым структурным элементом в поддержании целостности лимфатических сосудов, мы оценили лимфатическую сосудистую сеть в этом контексте.Анализ показал, что мыши E1 – / – и E1-E933A показали более высокую плотность LYVE-1-положительных сосудов; однако их функциональность была серьезно нарушена после индукции колита. Взятые вместе, эти результаты предполагают, что потеря экспрессии EMILIN-1 может вызвать снижение воспалительного процесса во время прогрессирования рака толстой кишки из-за уменьшения лимфотока и нарушения оттока воспалительных клеток.

Аббревиатуры

DSS

декстрансульфат натрия

CAC

рак, ассоциированный с колитом

LEC

лимфатические эндотелиальные клетки

Ключевые слова

Статьи внеклеточного матрикса

Рак, ассоциированный с колитом

(

) Рекомендуемые статьи

(

) Авторы.Опубликовано Elsevier BV

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Лизаты Methylococcus capsulatus Bath индуцируют постную микробиоту, кишечные Treg-клетки FoxP3 + RORγt + IL-17 + и улучшают метаболизм

ut Abstract

Взаимодействия между микробами и организмом-хозяином сообщества могут регулироваться диетой и играть ключевую роль в обеспечении иммунологического гомеостаза и здоровья. Здесь мы показываем, что потребление корма на основе лизатов целых клеток некомменсальной бактерии Methylococcus capsulatus Bath (McB) в качестве источника белка обращало вызванные высоким содержанием жира и высоким содержанием сахарозы изменения в микробиоте кишечника до состояния, напоминающего состояние постного мяса. мышей, получавших пищу с низким содержанием жира, как при умеренном тепловом стрессе (T 22 ° C ), так и при термонейтральности (T 30 ° C ).Кормление McB избирательно активировало тройные положительные (Foxp3 + RORγt + IL-17 + ) регуляторные Т-клетки в тонком кишечнике и толстой кишке и увеличивало продукцию слизи и статус гликозилирования, что свидетельствует об улучшении здоровья кишечника. Мыши, получавшие лизаты McB, дополнительно продемонстрировали улучшенную регуляцию глюкозы, снижение содержания жира в организме и печени, а также снижение иммунной инфильтрации в печени. В совокупности эти данные указывают на глубокое воздействие лизата McB на все тело, предполагая, что он может служить мощным модулятором иммунометаболического гомеостаза.

Введение

Кишечные микробы формируют кишечный иммунитет 1 и увеличивают биодоступность других неперевариваемых питательных веществ 2 . Следовательно, хорошо сбалансированная структура сообщества важна для иммунометаболического гомеостаза, тогда как аберрантные составы кишечной микробиоты связаны с многочисленными заболеваниями как внутри, так и за пределами желудочно-кишечного тракта 3 .

В то время как терапевтические последствия восстановления баланса неправильно настроенной микробиоты кишечника кажутся многообещающими, непоследовательная частота ответа в отношении как пробиотиков, так и исследований фекального переноса со случайными побочными эффектами подчеркивает сложность таких подходов.Один пример относится к многообещающему пробиотическому кандидату Akkermansia muciniphila 4 , где отрицательные эффекты наблюдались у реципиентов с ослабленным иммунитетом 5, 6 . Аналогичным образом, Prevotella copri способствует метаболизму волокон у здоровых людей 7 и защищает от бактериальной инвазии у мышей с высоким содержанием клетчатки, получавших пищу 8 , но при этом ассоциируется с инсулинорезистентностью у лиц с преддиабетическим ожирением и вызывает нарушения глюкорегуляции у индуцированных диетой ожирение (DIO) мышей 9 .

Альтернативой введению жизнеспособных микробов является использование лизатов целых клеток или отдельных клеточных компонентов неживых бактерий. Помимо снижения глобального спроса на энергию, при использовании в качестве источника питательных веществ, такие компоненты могут также сильно влиять на физиологию хозяина, как недавно сообщалось для A. muciniphila 10 и Bifidobacterium bifidum 11 . В последнем примере полисахариды клеточной поверхности B. bifidum использовали для индукции периферической иммунной толерантности посредством образования регуляторных Т-клеток (T regs ).Авторы сообщили о выраженном увеличении Foxp3 + RORγt + T regs ( p T regs ), особенно в собственной пластинке толстой кишки (LI) 11 . Считается, что этот тип клеток индуцируется комменсальными микробами и возник как мощная подгруппа T reg , демонстрирующая повышенную стабильность клонов и повышенную иммуносупрессивную способность во время воспаления кишечника по сравнению с обычным Foxp3 + RORγt T regs ( n T регистр ) 12 .

RORγt – канонический фактор транскрипции, контролирующий экспрессию IL-17; плейотропный цитокин как с провоспалительным, так и с иммуноразлагающим действием в зависимости от типа вызывающих клеток и физиологического контекста 13 . К сожалению, исследования, описывающие функцию p T reg , не измеряли секрецию IL-17. Таким образом, остается неизвестным, демонстрируют ли эти клетки нормальные, пониженные или повышенные уровни IL-17, и как это отражается на физиологии хозяина.Влияние этого преимущественно подмножества клеток толстой кишки на метаболизм хозяина также остается неизвестным. Тем не менее, все больше данных указывает на важность кишечного IL-17 для контроля метаболического гомеостаза 14, 15 . IL-17 + p T regs , следовательно, может использоваться как стратегия «двойного удара» для сдерживания иммунометаболической дисфункции и желудочно-кишечных расстройств на основе иммунорегуляторной способности p T regs , сопутствующей метаболической преимущества кишечного доставки IL-17.

С этой целью мы выдвинули гипотезу, что бактерии окружающей среды, которые не подвергались эволюционному изучению на предмет взаимодействия хозяина и микроба, будут обеспечивать неизученный резервуар иммуномодулирующих стимулов. В поддержку этой гипотезы ранее было показано, что метанотропная некомменсальная бактерия Methylococcus capsulatus Bath (McB) снижает воспаление и активность заболевания при колите, вызванном декстрансульфатом натрия (DSS) 24 . Однако влияние на метаболизм хозяина и иммунные клетки кишечника, а также на динамику слизи не изучалось.

Соответственно, мы исследовали эффект использования лизатов цельных клеток из McB в качестве источника белка для изменения иммунометаболизма и аберрантной микробиоты кишечника мышей DIO. Мы показываем, что лизаты McB увеличивают Foxp3 + RORγt + IL-17 + тройной положительный p T regs как в SI-, так и в LI-LP, и сбрасывают микробиоту ожирения, сопутствующую обратным ключевым признакам заболевания ожирение, вызванное диетой.

Материалы и методы

Мыши и этические заявления

Все эксперименты проводились в соответствии с директивой ЕС 2010/63 / EU, одобренной Датской инспекцией экспериментов на животных (№ 2014-15-2934-01,027).6-7-недельных самцов мышей C57BL / 6JBomTac и C57BL / 6JRj были приобретены из Taconic Laboratories, Дания или Janvier Labs, Франция, соответственно, как подробно описано ниже. Всем мышам позволяли акклиматизироваться к обычному питанию в течение первой недели по прибытии, а затем кормили LFD в течение двух недель до начала исследования. Мышей содержали в определенных условиях, свободных от патогенов, при температуре 22 ° C (T 22 ° C ) или 30 ° C (T 30 ° C ), как указано, в 12-часовом цикле свет / темнота (6:00 – 18:00).

Размещение, диеты и экспериментальная установка

Стандартные гранулированные диеты, а также порошок западной диеты без белков (WD) были получены от Ssniff Spezialdiäten GmBH, Германия, и хранились при -20 ° C на протяжении всего эксперимента.Мышей кормили диетой с низким содержанием жиров (LFD, S8672-E050) определенного состава до начала исследования. Подгруппа осталась на LFD, тогда как оставшиеся мыши были переведены на контрольный WD на основе соевого масла (S8672-E025) (с высоким содержанием жира, высоким содержанием сахарозы, содержащим 0,15% холестерина) на вводный период (12 или 21 неделя в зависимости от эксперимент). Экспериментальные WD были сопоставлены по партиям и получены без белка (S9552-E021), который впоследствии был добавлен и затем осажден исследователями, как указано; WD REF = содержит 19.5% (вес / вес) казеина, WD CNTL = содержащий 16,5% (вес / вес) казеина и 3% масла макадамии, WD McB = 19,5% (вес / вес) лизатов цельноклеточных бактерий (преимущественно белков, но до ∼15% фосфолипидов 16 ). Состав рациона более подробно описан в Таблице S1. Подробное описание бактериальных лизатов приведено в соответствующем разделе ниже. Все диеты были свежеприготовленными для каждого эксперимента с независимыми партиями бактериальных лизатов, чтобы подтвердить надежность и воспроизводимость наблюдаемых результатов.Мышей кормили ad libitum , и потребление корма измеряли трижды в неделю. Воду меняли еженедельно.

12 + 6 протокол T
22 ° C

Экспериментальная установка показана на рисунке 1A. Мыши C57BL / 6JRj были приобретены в Janvier Labs, Франция, и содержали по 3 мыши на клетку, воспроизведенных в двух независимых экспериментах. Для прозрачности все данные изображены на соответствующих графиках со средним значением ± стандартная ошибка среднего плюс отдельные точки для объединенных результатов двух независимых экспериментов.Формы, зависящие от эксперимента, позволяют визуально различать соответствующие эксперименты, а также распределять данные внутри и между экспериментами.

Рисунок 1: Кормление McB обращает изменения микробиоты кишечника, вызванные WD, и увеличивает уровни SCFA в слепой кишке:

A) Схема исследования двух независимых экспериментов с начальной западной диетой (WD REF ) кормление в течение 12 недель при 22 ° C и пероральное тест толерантности к глюкозе (OGTT), глюкозо-стимулированная секреция инсулина (GSIS) и состав тела с помощью МРТ-сканирования, оцененных через 11 недель для стратификации групп (☐), с последующим диетическим вмешательством в течение 6 недель кормления WD, включая лизат McB (WD McB ) или подобранную контрольную диету WD (WD CNTL ).В течение экспериментального периода через указанные интервалы проводились исследования состава тела, OGTT, GSIS и отбор свежих фекалий. Тест на толерантность к инсулину (ITT) проводили в первом из двух экспериментов в указанный момент времени. Второй эксперимент включал контрольную группу мышей, получавших питание с низким содержанием жиров (LFD). Группы или процедуры, однозначно представленные в одном эксперименте, выделены курсивом. B) Анализ основных координат (PCoA) с использованием взвешенных расстояний UniFrac для фекальной микробиоты, отобранных в первом и втором эксперименте раз в две недели в течение периода диетического вмешательства, как показано числами после диетического вмешательства в центроидах.Группы WD CNTL и WD McB были схожи по составу микробиоты до диетического вмешательства на неделе 12 + 0 (PERMANOVA p = 0,88 и 0,43 в Exp1 и Exp2, соответственно). В конце каждого эксперимента состав микробиоты значительно отличался между этими группами (PERMANOVA p = 0,001 и 0,002 в Exp1 и Exp2, соответственно). C) Taxasсводка наиболее распространенных бактериальных родов, показывающая среднюю относительную численность в% указанного семейства и родов в каждой группе в указанные моменты времени D) Deseq анализ численности родов фекальных бактерий, значительно регулируемых вмешательством McB по сравнению с WD CNTL (стр.прил. <0,05). Относительная численность в% в каждой группе и вариация показаны для каждого регулируемого рода в выбранные временные точки. Изменения кратности и скорректированные значения p для индивидуума указаны в таблице S3. E) Соотношение Firmicutes / Bacteroidetes в образцах фекалий отдельных мышей до (12 + 0) и после 6 недель диетического вмешательства (12 + 6) в Exp1 (◆) и Exp2 (●). n = от 6 (LFD) до 15 (WD McB и WD CNTL ). Статистическая значимость обозначена * в парном t-тесте. F) Взвешенное расстояние UniFrac (тест нестабильности) между парными образцами из указанного двухнедельного интервала после диетического вмешательства в Exp1 (◆) и Exp2 (●). n = от 6 (LFD) до 15 (WD McB и WD CNTL ). Статистическая значимость обозначена * в парном t-тесте. GH) Основные короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA) (ацетат, пропионат и бутират) и второстепенные SCFA (изобутират, изовалерат и валерат) в содержимом слепой кишки как кратное изменение пмоль на слепую кишку в Exp1 (◆) и Exp2 (● ).n = 6 (LFD) и 10-11 (WD CNTL и WD McB соответственно). Статистическая значимость по сравнению с WD CNTL с помощью однофакторного дисперсионного анализа с множественным сравнением и апостериорного анализа Даннета обозначена *. E-H) * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

21 + 5 протокол T
30 ° C

Экспериментальная установка показана на рисунке 4A. Мышей C57BL / 6JBomTac покупали в Taconic Laboratories, Дания, и первоначально содержали по 10 мышей на клетку для ускорения набора веса.Через 12 недель вводного периода мышей помещали в одиночную клетку, чтобы дать возможность точной оценки потребления пищи, а также контролировать, будет ли более чувствительный микробиом мышей в одиночном корпусе равномерно изменяться в сторону состава, типичного для мышей, получавших LFD, или если таковой Этот феномен основывался на том, что несколько мышей с высокой ответной реакцией переносили свой микробиом товарищам по клетке в условиях группового содержания. Выбор времени для одиночного размещения позволил затронутым мышам адаптироваться к социальной изоляции и стабилизировать рост своего веса до вмешательства (Рисунок S4B).

Выращивание

M. capsulatus Ванна и приготовление бактериального лизата

Methylococcus capsulatus Bath (NCIMB 11132) культивировали в среде с нитратными минеральными солями (NMS), как описано ранее 17 для получения бактериального лизата одного штамма . Аликвоты культуры McB замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C. Культивирование на чашках с агаром и во встряхиваемых колбах (орбитальный шейкер-инкубатор при 200 об / мин) проводили при 45 ° C в атмосфере 75% воздуха 23.25% CH 4 и 1,25% CO 2 . Непрерывное культивирование проводили в 3-литровом биореакторе (Applikon, Нидерланды) с рабочим объемом 2 литра. Клетки предварительно культивировали во встряхиваемых колбах и использовали для инокуляции биореактора до оптической плотности 0,1 при 440 нм (OD 440 ). Температуру поддерживали на уровне 45 ° C, скорость перемешивания устанавливали на 650 об / мин, а pH поддерживали на уровне 6,8 путем автоматического добавления 2,5 M NaOH / 2,5 M HCl. В биореактор барботировали газовую смесь из 75% воздуха и 25% метана.Непрерывное культивирование было начато после начальной фазы партии, и скорость разведения была установлена ​​на 0,01 ч -1 . OD , 440, в устойчивом состоянии обычно поддерживалась на уровне приблизительно 10. Культуральные стоки собирали, и клетки собирали центрифугированием. Стенки бактериальных клеток были разрушены при использовании френч-пресса перед лиофилизацией материала.

Тесты на толерантность к глюкозе и инсулину

Мышей подвергали магнитно-резонансному (МР) сканированию с использованием EchoMRI 4in1 (Техас, США) для определения жировой и мышечной массы в указанные моменты времени (рис. 1A, 4A).Мышей не кормили за 5 или 2 часа до любого перорального теста на толерантность к глюкозе (OGTT) или внутрибрюшинного теста на толерантность к инсулину (ITT), соответственно. Уровень глюкозы в крови натощак измеряли по кровотечению из хвостовой вены с помощью глюкометра Bayer Contour (Bayer Health Care). Впоследствии мышам вводили через зонд 3 мкг глюкозы / г безжировой массы (OGTT) или внутрибрюшинно вводили 0,75 мЕд инсулина / г безжировой массы (ITT). Кровь отбирали в определенные моменты времени для измерения уровня глюкозы в крови и инсулина для оценки глюкорегуляторной способности, включая секрецию инсулина, стимулированную глюкозой (GSIS), как подробно описано в другом месте 18 .

Измерения короткоцепочечных жирных кислот

Короткоцепочечных жирных кислот (SCFA) определяли газохроматографическим анализом. Фекалии суспендировали в воде MilliQ (1: 1 (мас. / Об.)) И затем гомогенизировали в установке для пробоподготовки FastPrep-96 (MP Biomedicals). Гомогенаты разбавляли 0,4% муравьиной кислотой (1: 1 (об. / Об.)), Переносили в пробирки Эппендорфа и центрифугировали при 13000 об / мин в течение 10 минут. 300 мкл супернатантов наносили на спин-колонки (VWR, размер пор 0,2 мкм) и центрифугировали при 10000 об / мин в течение 5 минут.Элюаты переносили во флаконы для ГХ объемом 300 мкл. Использовался режим раздельного ввода с объемом ввода 0,2 мкл. Газовый хроматограф представлял собой Trace 1310 (Thermo Scientific), оборудованный автосамплером и пламенно-ионизационным детектором. В качестве газа-носителя использовали гелий, а колонка представляла собой Stabilwax (Restek) длиной 30 м с полиэтиленгликолем в качестве неподвижной фазы. Температура инжектора: 250 ° C, температурные интервалы: 2 минуты при 90 ° C, затем повышение на 6 минут до 150 ° C, затем повышение на 2 минуты до 245 ° C и выдержка при этой температуре в течение 4.9 мин. Температура детектора: 275 ° C.

Экстракция РНК и количественная ОТ-ПЦР

Замороженная ткань печени была подвергнута крио-измельчению ступкой и пестиком на жидком азоте, и общая РНК была экстрагирована с помощью TRIreagent (Sigma-Aldrich, США) в соответствии с протоколом производителя с использованием PRECELLYS® 24 для гомогенизации. . Один мкг РНК транскрибировали в кДНК с помощью обратной транскриптазы (Invitrogen, США). Количественные ПЦР-анализы проводили с использованием основной смеси SYBR Green qPCR (Thermo Scientific, США) и системы qPCR Stratagene Mx3000P.Стандартная кривая и контроль без матрицы (NTC) были включены в каждые 96-луночные планшеты. Проверка каждой мишени была основана на Rsq стандартной кривой> 0,995, эффективности усиления 100 ± 10% и единственном пике. Значения Ct для каждой мишени соотносились с контрольными значениями Ct 18S того же образца на 2 ΔCt и визуализировались как кратное изменение среднего значения контрольной группы LFD. Последовательности праймеров приведены в таблице S2.

Гистология

Образцы ткани печени брали сразу после эвтаназии, фиксировали в 10% формалине и затем заливали парафином перед разделением на срезы в соответствии со стандартными процедурами световой микроскопии.Толстую кишку опорожняли для содержимого и затем обматывали вокруг иглы 27G, после чего полученные роллы Swizz тщательно консервировали в жидком азоте (завернутые в алюминиевую фольгу) до замачивания парафином. Вложенные ткани вырезали толщиной 2 мкм и помещали на предметные стекла. Эти срезы были дополнительно обработаны и окрашены либо гематоксилином и эозином (H&E), Oil Red O, PAS или HID-AB, либо помечены антителами, представляющими интерес для иммуногистохимических исследований, как подробно описано ниже.Образцы были рандомизированы и закрыты для патологов, выполняющих гистологический анализ.

Печень
Оценка активности неалкогольной жировой болезни печени (NAS)

Срезы печени были подготовлены по стандартным протоколам и впоследствии оценены двумя независимыми наблюдателями слепым методом с использованием установленной шкалы активности НАЖБП (NAS) для оценки H&E окрашенные срезы печени 19 . Короче говоря, оценка от 0 до 2 исключает неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), оценка от 3 до 4 определяет «пограничный НАСГ», а оценка ≥ 5 считается НАСГ.

Окрашивание Oil Red O

Биопсии печени фиксировали в параформальдегиде, криозащищали поливинилпирролидоном / сахарозой и замораживали в жидком азоте. Криосрезы готовили и окрашивали липид-специфическим Oil red O (Sigma Aldrich, Германия) и анализировали под микроскопом Axio Imager M2. Изображения были получены с помощью цветной камеры Axiocam 506 (Zeiss, Йена, Германия). Площади окрашенных липидов определяли с помощью программного обеспечения ImageJ-1.50i (https://imagej.nih.gov/ij/index.html).

Толстая кишка

Морфологические и морфометрические оценки тканей толстой кишки проводились вслепую, и все измерения проводил один и тот же обученный патолог. Один окрашенный H&E срез толстой кишки от каждого человека оценивали гистологически на наличие каких-либо признаков патологии. Чтобы оценить качество муцинов, ткани толстой кишки окрашивали как на кислые, так и на нейтральные муцины. Нейтральные муцины окрашивали Periodic Acid Schiffs (PAS). Кислые муцины окрашивали с помощью комбинации диамина с высоким содержанием железа (HID) для сульфатированных муцинов (сульфомуцинов) и альцианового синего (AB) для карбоксилированных муцинов (сиаломуцинов).Измерения глубины крипт (CD), а также анализ типа и количества муцина были выполнены на HID / AB- и PAS-окрашенных срезах в трех гистологически различных областях толстой кишки, то есть проксимальной, средней и дистальной области. В каждом из этих трех мест были измерены три крипты с продольным разрезом. Таким образом, каждая точка данных представлена ​​в виде среднего значения трех (тип и количество муцина) или шести (CD) измерений. Крипты отбирались только тогда, когда весь эпителий крипт был виден от lamina muscularis mucosae до просвета.Гистологические срезы толстой кишки исследовали в микроскопе Axio Imager Z2 (Zeiss, Йена, Германия), а цифровые изображения получали с помощью цветной камеры Axiocam 506 (Zeiss, Йена, Германия). Микрофотографии были сделаны с тем же увеличением объектива 20x. Измерения глубины крипты проводились с помощью программы Image J-Fiji version 1.52e Java 1.8.0_181 20 . Для количественной оценки и автоматической оценки различных типов муцина использовался плагин для деконволюции цвета для программы Image J-Fiji 21 .

Липидомия печени

Образцы были рандомизированы и липид экстрагирован, как описано ранее. Короче говоря, 50 мг замороженной ткани гомогенизировали в предварительно охлажденной пробирке объемом 2 мл, добавляли 0,5 мл ледяного 50% MeOH с ~ 40 мкМ D5-триптофана, следуя стандартным протоколам, и хранили при -80 ° C до анализа LCMS. Список пиков, полученный после предварительной обработки (характеристики, определяемые их значением массы / заряда, временем удерживания и площадью пика), был проанализирован в MetaboAnalyst 4. Затем данные были автоматически масштабированы (центрирование среднего значения и деление на квадратный корень из стандартного отклонения каждой переменной) для обеспечения распределения Гаусса, позволяющего относительное сравнение.Одномерный и многомерный анализ выполняли с помощью t-критериев, графика вулканов, дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом HSD Тьюки и анализом главных компонентов (PCA) для обнаружения значимых попаданий и визуального разделения тенденций между группами. Признаки, показывающие аналогичный образец между LFD и WD McB , были идентифицированы функцией сопоставления с образцом. Затем 25 лучших характеристик были обработаны для идентификации с использованием онлайн-базы данных Lipidmaps (http://lipidmaps.org) с допуском по массе между измеренным значением m / z и точной массой 3 ppm.

Анализ микробиома и биоинформатическая обработка

Свежие образцы фекалий собирали через 3-4 часа светового цикла, мгновенно замораживали и хранили при -80 ° C до последующей обработки. Бактериальную ДНК из образцов фекалий экстрагировали с использованием почвенного набора NucleoSpin (Macherey-Nagel) в соответствии с инструкциями производителя. Амплификацию гена 16S рРНК, подготовку библиотеки и секвенирование выполняли, как описано ранее 22 . Первоначальная обработка данных была выполнена, как описано в другом месте 23 .Данные были сокращены до 23 107 чтений на образец. Анализ главных координат (PCoA) проводился на основе взвешенного расстояния UniFrac. Для выбора ОТЕ и видов, обогащенных разными подгруппами, использовался DESeq2 24 с настройками по умолчанию. Относительная численность OTU была агрегирована до уровня родов. Роды, присутствующие в> 1/3 образцов, использовались в тестировании дифференциальной численности. Genera с p.adj. Сообщалось о <0,05 при сравнении последней точки отбора проб для WD REF / WD CNTL и WD McB с анализом дифференциальной экспрессии DESeq2 на основе отрицательного биномиального распределения.Перестановочный многомерный дисперсионный анализ (permanova) с использованием взвешенных матриц расстояний UniFrac (Adonis, пакет Vegan R) использовался для оценки общего микробного состава.

Выделение клеток собственной пластинки тонкой кишки (SI) и толстой кишки (LI)

Фекалии и слизь из LI соскабливали, а SI промывали 1x HBSS (Gibco), содержащим 15 мМ HEPES (Thermo Scientific). Пятна Пея были аккуратно удалены из SI. SI и LI были открыты в продольном направлении, разрезаны на части размером ок.Кусочки размером 1 см и промыли 3 раза 1x HBSS (Gibco), содержащим 15 мМ HEPES (Thermo Scientific), 5% FCS (Viralex TM , PAA Laboratories), 50 мкг / мл гентамицина (Gibco) и 2 мМ EDTA (Invitrogen, Life Technologies) в течение 15 мин при 37 ° C. На первом этапе инкубации к образцам LI дополнительно добавляли 0,15 мг / мл DL-дитиотреитола (Sigma-Aldrich). Образцы LI, но не SI, встряхивали на орбитальном шейкере при 350 об / мин во время инкубации. После каждого этапа инкубации образцы SI, но не LI, встряхивали вручную в течение 10 с.Среды, содержащие эпителиальные клетки и дебрис, отбрасывали фильтрованием через сетку 250 мкм (Tekniska Precisionsfilter, JR AB). Оставшуюся ткань расщепляли в течение 25-28 минут при 37 ° C при перемешивании на магнитной мешалке (500 об / мин) в среде R-10 (RPMI 1640 (Gibco) с 10% FCS (Viralex, PAA Laboratories), 10 мМ HEPES (Thermo Scientific). , 100 Ед / мл пенициллина (Gibco), 100 мкг / мл стрептомицина (Gibco), 50 мкг / мл гентамицина (Gibco), 50 мкМ 2-меркаптоэтанола (Gibco) и 1 мМ пирувата натрия (Gibco)), содержащих 1 мг / мл коллагеназа P (Roche) и 0.03 мг / мл ДНКазы I (Roche). После переваривания клетки SI-LP и LI-LP очищали центрифугированием в градиенте плотности (600 rcf в течение 20 мин при 22 ° C, ускорение 5 и тормоз 0) с 40/70% Percoll (GE Healthcare). Затем клеточные суспензии фильтровали через сетчатые фильтры для клеток 100 мкм (BD Biosciences) и повторно стимулировали in vitro перед окрашиванием для проточного цитометрического анализа.

Ex vivo стимуляция SI-LP и LI-LP клеток

SI-LP и LI-LP клетки повторно стимулировались in vitro , как описано ранее 25 .Вкратце, клетки моделировали в среде R-10 в присутствии либо 20 нг / мл IL-23 (R&D Systems), либо 250 нг / мл PMA (Sigma-Aldrich) в сочетании с 0,5 мкг / мл иономицина (Sigma-Aldrich). в течение 4 часов при 37 ° C. После 1 ч инкубации добавляли 10 мкг / мл брефельдина A (BioLegend).

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия выполнялась в соответствии со стандартными процедурами. Агрегаты клеток (идентифицированные на диаграммах разброса FSC-H по сравнению с FSC-A) и мертвые клетки, идентифицированные с помощью набора Zombie Aqua Fixable Viability Kit (BioLegend), были исключены из анализа.Внутриклеточное окрашивание выполняли с использованием набора буферов для окрашивания eBioscience FoxP3 / транскрипционного фактора (eBioscience) в соответствии с инструкциями производителя. Данные были получены на LSRII (BD Biosciences) и проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo (Tree Star).

Антитела (Abs) и реагенты

В исследовании использовались следующие mAb и реагенты: анти-CD3ε (17A2), анти-CD4 (GK1.5), анти-CD8α (53-6,7), анти-CD11c ( N418), анти-CD19 (6D5), анти-CD45 (30F11), анти-CD45R / B220 (RA3-6B2), анти-CD90.2 (30-h22), анти-CD127 (A7R34), анти-Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) (RB6-8C5), анти-Ter119 (TER-119), анти-TCRβ (H57-597 ), анти-TCRγδ (GL3), анти-NK1.1 (PK136), анти-NKp46 (29A1.4), анти-FoxP3 (FJK-16s), анти-RORγt (B2D), анти-T-bet (4B10 ), анти-IL-17A (TC11-18h20.1), анти-IL-22 (IL22JOP) и анти-IFNγ (XMG1.2). Все Abs были приобретены у eBioscience, BioLegend или BD Biosciences. Стрептавидин, конъюгированный с PECF594, был приобретен у BD Biosciences.

Мультиплексный количественный анализ цитокинов

Ткани печени измельчали ​​пестиком в ступке на жидком азоте.30-40 мг ткани переносили в чистую пробирку и добавляли 400 мкл буфера реагента для экстракции тканевого белка T-PER (Thermo Scientific), включающего ингибиторы протеиназы (Sigma-Aldrich). Концентрацию белка оценивали с помощью BCA (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Цитокины были количественно определены с использованием технологии xMAP с комбинациями предварительно смешанных панелей мышиных цитокинов Bio-Plex Pro (BioRad), и анализы были выполнены на системе Bio-Plex 200 и программном пакете Bio-Plex Manager.

Статистический анализ

Данные Omics были получены, как описано в соответствующих разделах. Остаточные отклонения нормальности оставшихся данных оценивались комплексным методом Д’Аугостино-Пирсона (k2), Graphpad Prism 8, а затем оценивались с помощью параметрических (гауссовское распределение) или непараметрических (негауссовское распределение) тестов, в зависимости от ситуации. Подробная информация о каждом тесте, включая апостериорную оценку, указана в подписях к рисункам. Данные выражены в виде среднего значения ± SEM с отдельными точками, и все группы сравниваются с соответствующей группой WD REF или WD CNTL , как указано.

Результаты

Кормление McB отменяет вызванные WD изменения микробиоты кишечника и увеличивает уровни SCFA в слепой кишке.

Чтобы вызвать ожирение и иммунометаболические дисфункции, мышей C57BL / 6JRj первоначально кормили WD с ожирением. После 12 недель кормления WD мышей были разделены на новые группы в зависимости от веса, жировой массы и глюкорегуляторной способности (рис. 1A) и кормили экспериментальных WD в течение дополнительных 6 недель. Хотя известно, что диетический жир вызывает воспроизводимые и липид-зависимые изменения в микробиоме кишечника мышей в различных диетических композициях 26 , о влиянии белка на микробиом известно меньше.Таким образом, чтобы выяснить, повлияет ли диетический белок (то есть казеин по сравнению с лизатами цельноклеточных бактерий) на структуру сообщества микробиоты кишечника, мы проанализировали свеже собранные образцы фекалий до и во время диетического вмешательства. У мышей LFD и WD REF после 12 недель кормления наблюдались отчетливые профили кишечной микробиоты (исходный уровень вмешательства, неделя 12 + 0; рис. 1B, C), включая примерно в 10 раз меньшую численность видов, способствующих укреплению здоровья, Parasutterella . 27 и Parabacteroides 28 , которым противодействует одинаково увеличившаяся численность родов Desulfivobrio 30, 31 , ассоциированных с ожирением (рис. 1D), а также ∼4-кратное увеличение числа Firmicutes с до Соотношение Bacteroidetes (F / B) (рис. 1E).Интересно, что у мышей, которых кормили WD CNTL , наблюдались незначительные изменения в сигнатуре микробиома в течение 6 недель вмешательства (рис. 1B-F и S1A-B), что позволяет предположить, что добавленный источник липидов имел ограниченное влияние на экологию кишечника. В отличие от этого наблюдения, мы отметили явное изменение бактериального состава у мышей, получавших WD McB . В течение первых 2 недель лечения общая структура сообщества у этих мышей сместилась в сторону их коллег, получавших LFD (рис. 1B-F, таблица S3).Затем мы спросили, связаны ли наблюдаемые таксономические различия между группами с изменениями функционального потенциала. SCFAs являются основными конечными продуктами метаболизируемых волокон и, в меньшей степени, аминокислотами, ускользающими от переваривания в SI, с огромным влиянием на физиологию хозяина 32, 33 . Наивысшие уровни SCFAs обнаружены в слепой и проксимальной части толстой кишки 34 . Поэтому мы исследовали, были ли уровни SCFA в слепой кишке разными в разных группах. Мы обнаружили последовательное увеличение уровней трех основных, а также трех второстепенных классов SCFA в слепой кишке мышей, получавших WD McB , по сравнению с аналогами, получавшими WD CNTL , что указывает на не только таксономически, но и функционально дискретную микробиоту. профили в двух группах мышей, подтверждающие положительное влияние на здоровье включения лизатов McB в рацион (рис. 1G-H).

WD

McB кормление стимулирует индукцию кишечных регуляторных Т-клеток

Сложная взаимосвязь между кишечными микробами и иммунитетом хозяина в сочетании с иммунорегуляторной способностью SCFAs 35 побудила нас исследовать, опосредованы ли наблюдаемые изменения, опосредованными WD. Кормление McB было связано с иммунными нарушениями.

Соответственно, мы проанализировали профиль иммунных клеток SI-LP и LI-LP в подгруппе экспериментальных мышей (n = 6-10 / группа) с использованием многоцветной проточной цитометрии, уделяя особое внимание фенотипической характеристике врожденных лимфоидных клеток группы 3 (ILC3). естественные клетки-киллеры (NK) и Т-клетки (стратегии стробирования см. на Рисунке S2A-B).Количество ILC3, NK-клеток и Т-клеточного рецептора (TCR) -γδ + T-клеток было одинаковым между группами (рисунок S2C-E). То же самое верно для количества TCRβ + CD4 + Т-клеток, а также для доли Т-хелперов (T H ) 1-, T H 17- и n T regs ячеек (рис. 2A-B).

Рисунок 2: кормление WD McB стимулирует индукцию кишечных регуляторных Т-клеток:

A-D) Количество указанных клеток в толстой кишке из Exp1 (◆) и Exp2 (●).EG) Репрезентативные графики TCRb ободочной кишки + CD4 + FoxP3 + RORγt + p T regs (слева) и IL17 + p T regs (справа) в LFD ( E), WD CNTL (F) и WD McB (G). H-K) Количество указанных клеток в тонком кишечнике из Exp1 (◆) и Exp2 (●). LN) TCRb + CD4 + FoxP3 + RORγt + p T regs (слева) и IL17 + p T regs (справа) в LFD (L) , Группа WD CNTL (M) и WD McB (N). A-N) n = от 6 (LFD) до 10 (WD McB и WD CNTL ). A-D, H-K) Статистически значимые отличия от группы WD CNTL с помощью однофакторного дисперсионного анализа с множественными сравнениями и апостериорного анализа Даннета обозначены *. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Интересно, что доля p T regs была более чем в 2 раза увеличена в LI-LP мышей, получавших WD McB , по сравнению с аналогами, получавшими WD CNTL (Рисунок 2C, p <0.001). Примечательно, что эта подгруппа регуляторных Т-клеток, как было показано, сдерживает воспаление кишечника 12 и опосредует иммунологическую толерантность к кишечному патобионту Helicobactor hepaticus , тем самым защищая от T H 17-опосредованной дисфункции барьера и последующего колита 36 . Поскольку RORγt является отличительным фактором транскрипции для дифференцировки клеток T H 17 и необходим для выработки ими IL-17, мы затем оценили, способны ли p T regs , индуцированные различными диетами, также экспрессировать IL-17.Действительно, ex vivo стимулированный LI-LP p T regs продуцировал значительные и зависящие от диеты количества белка IL-17 (фигура 2D-G, p <0,001). Аналогичный фенотип наблюдался в SI-LP (рис. 2H-N), где p T regs у мышей, которых кормили WD McB , достигало ~ 3-кратного увеличения по сравнению с мышами, которых кормили WD CNTL (рис. 2J , p <0,001).

WD

McB снижает ожирение, вызванное диетой

Измененный иммунный профиль в сочетании со сдвигом микробиоты кишечника в сторону состояния, аналогичного тому, которое наблюдается у мышей, получавших тощие LFD, потенциально может вызвать перекрестные помехи с органами глюкорегуляции.Чтобы проверить, могут ли лизаты McB обратить нарушенную регуляцию глюкозы, мы выполнили OGTT и оценили GSIS, сопутствующие составу массы тела у мышей с ожирением, получавших WD REF , в течение 11 недель и после 5 недель диетического вмешательства с учетом временного анализа (Рисунок 1A). Все мыши были разделены на экспериментальные группы на основе их глюкорегуляторной способности до вмешательства (рисунок S3A-B). В то время как реакция на провокацию глюкозой оставалась в значительной степени неизменной с 11-й по 12-ю + 5-ю недели, независимо от экспериментальной диеты (рис. 3A-C), как уровни инсулина 5-часового голодания, так и стимулированные глюкозой ответы инсулина были значительно увеличены у мышей, получавших WD CNTL ( Рисунок 3E, p <0.01 & p <0,001 соответственно) в соответствии с нашим предыдущим отчетом о зависимых от времени изменениях в регуляции глюкозы 37 . Мыши, получавшие корм LFD и WD McB , были полностью защищены от этой пагубной траектории (рис. 3D, F и S3C, p = 0,24 и 0,68, соответственно), а мыши, получавшие корм WD McB , также демонстрировали умеренно улучшенную чувствительность к инсулину на основе 5-часовая гликемия натощак (Рисунок 3C, p <0,05) и тест на толерантность к инсулину внутрибрюшинно (Рисунок 3G, p <0.05).

Рисунок 3: Диетическое вмешательство с McB препятствует прогрессированию инсулинорезистентности и накоплению жировой массы:

AC) Пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT) и определение уровня глюкозы в крови натощак за 5 часов до диетического вмешательства (11-я неделя) и через 5 недель после вмешательства (неделя). 12 + 5) групп LFD (A), WD CNTL (B) и WD McB (C), показывающих среднее значение ± SEM двух независимых экспериментов. DF) Стимулированная глюкозой концентрация инсулина во время OGTT и уровни инсулина натощак через 5 часов до диетического вмешательства (11 неделя) и через 5 недель после вмешательства (неделя 12 + 5) LFD (D), WD CNTL (E) и Группы WD McB (F), показывающие среднее значение ± SEM двух независимых экспериментов. G) Интраперитонеальный тест на толерантность к инсулину (ITT) через 3 недели после диетического вмешательства, показывающий среднее значение ± SEM. H) Увеличение массы тела. Мышей кормили либо LFD, либо WD REF в течение первых 12 недель с последующим 6-недельным периодом диетического вмешательства, показывающим среднее значение ± SEM двух независимых экспериментов. Пунктирная вертикальная линия обозначает начало вмешательства. I) Жировая масса в граммах в течение периода диетического вмешательства (неделя 12 + 0–12 + 6), измеренная с помощью МРТ-сканирования, показывающая среднее значение ± SEM двух независимых экспериментов. J) Среднее потребление корма на клетку в граммах на мышь в течение 48 часов в Exp1 (◆) и Exp2 (●). K) Содержание жира и белка в кале в Exp1 (◆) и Exp2 (●). L) Оценка активности НАЖБП на основе степени стеатоза печени (0-3), воспаления (0-2) и гепатоцеллюлярного раздува (0-3) по степени слепой гистологической оценки ткани печени в Exp1 (◆) и Exp2 (●) . M) Типичное окрашивание H&E ткани печени из указанной экспериментальной группы. A-F) n = от 6 (LFD) до 15 (WD McB и WD CNTL ).Статистическая значимость в каждой временной точке обозначена знаком * при парном двустороннем ANOVA-RM с апостериорным тестом Бонферрони. Уровни глюкозы и инсулина натощак оценивали с помощью парных t-критериев. G) n = от 8 (WD McB ) до 9 (WD CNTL ). Статистическая значимость в каждой временной точке обозначена знаком * во время двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA-RM с апостериорным тестом Бонферрони. H-I) от n = от 6 (LFD) до 15 (WD McB и WD CNTL ). Статистическая значимость обозначена *.LFD и WD McB сравнивали с WD CNTL с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA-RM, скорректированного с учетом множественных сравнений с помощью апостериорного анализа Даннета. J-K) Каждая точка данных похожа на среднее значение для одной клетки. n = от 2 (LFD) до 5 (WD McB и WD CNTL ). Статистическая значимость обозначена *. LFD и WD McB сравнивали с WD CNTL с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA-RM, скорректированного с учетом множественных сравнений с помощью апостериорного анализа Даннета. L) n = от 6 (LFD) до 13 (WD McB и WD CNTL ).Статистическая значимость обозначена *. LFD и WD McB были сравнены с WD CNTL Краскалом-Уоллисом, скорректированным с учетом множественных сравнений, сделанных постфактум Данна. A-L) * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

В целом увеличение веса имитировало глюкорегуляторную способность. Таким образом, мыши, получавшие корм WD McB , демонстрировали стабильность веса, жировой массы и мышечной массы при переходе на экспериментальную диету, в отличие от непрерывного роста массы и массы жира у мышей, которых кормили WD CNTL (рис. 3H-I и S3D).Отсутствие прибавки в весе не объяснялось снижением потребления корма (рис. 3J), а скорее, по-видимому, было связано с повышенной секрецией каловой энергии (рис. 3J-K). Поскольку ожирение и нарушение регуляции глюкозы тесно связаны с НАЖБП 38 , мы затем подвергли залитые парафином срезы печени гистологической оценке. Эти анализы выявили уменьшение стеатоза и гепатоцеллюлярного раздувания у мышей, получавших WD McB , по сравнению с аналогами, получавшими WD CNTL-, где особенно гепатоцеллюлярный раздувание было остановлено (или возвращено) в состояние, напоминающее состояние у мышей, получавших тощие LFD (рис. 3L). -М, р <0.05). Важно отметить, что гепатоцеллюлярный баллон играет важную роль в развитии более тяжелого заболевания печени, NASH 38 .

Кормление WD

McB сбрасывает липидом печени и снижает иммунную инфильтрацию печени, облегчая НАЖБП. Фигура 4A) с использованием недавно описанного метода 39 , где термонейтральное содержание (T 30 ° C ) усиливает НАЖБП у мышей WT C57BL / 6J, получавших ожирение в течение 20-24 недель.Чтобы более тщательно изучить влияние кормления WD McB , мы также переработали рацион и исключили масло макадамии в группе WD CNTL , так как это может привести к прогрессированию ожирения (рис. 3) и связанных с ним расстройств. Этот новый дизайн диеты повлек за собой повышенное соотношение жир / белок в WD McB по сравнению с WD REF из-за фосфолипидов, изначально присутствующих в бактериальных лизатах 16 (Таблица S1). Несмотря на более низкое содержание белка в WD McB по сравнению с обеими другими диетами, доступность белка была намного выше критических уровней, что подтверждается аналогичной безжировой массой мышей, получавших WD REF , после вмешательства в диету (рисунок S4A).Тем не менее, мыши, получавшие корм WD McB , показали значительно улучшенные уровни инсулина в течение 5 часов натощак и снижение жировой массы (Рисунок 4B-C), несмотря на поддержание веса и значительно увеличенное потребление энергии по сравнению с мышами, получавшими LFD и WD REF (Рисунок S4B- D). Снижение жировой массы тела сопровождалось уменьшением НАС, что подтверждается как патологической оценкой срезов печени, окрашенных H&E (рис. 4D-E), так и содержанием липидов в гепатоцитах, оцененным с помощью окрашивания Oil-Red-O (рис. 4F-H).Мы дополнительно наблюдали повышенную секрецию адипонектина (рис. 4I), что указывает на повышение чувствительности к инсулину в группе WD McB , что дополнительно подтверждается оценкой толерантности к инсулину и активности транскрипции генов печени ключевых метаболических ферментов (рис. 4J-K). Интересно, что мы наблюдали> 10-кратное подавление активности Scd1 в печени мышей, получавших WD McB , печеночная экспрессия которых а) регулируется микробиотой 40 и б) играет важную роль в de novo. липогенез в начале метаболического синдрома 41 .

Рис. 4: Диетическое вмешательство McB улучшает индуцированный диетой метаболический и печеночный фенотип после длительного кормления WD:

A) Схема исследования с начальной западной диетой (WD REF ) при кормлении в течение 21 недели при 30 ° C. Тест на толерантность к инсулину (ITT) и состав тела с помощью МРТ-сканирования оценивали через 20 недель для разделения групп () с последующим диетическим вмешательством в течение 5 недель кормления либо WD REF , либо WD, включая лизат McB (WD McB ). Контрольную группу, получавшую низкожировую диету (LFD), использовали на протяжении всего эксперимента (от 0 до 21 + 5 недель).Состав тела, ITT и отбор свежих фекалий проводились через указанные интервалы. Первые 12 недель мышей содержали вместе, а затем разделили по отдельным клеткам. B) Уровни инсулина в плазме крови через 5 часов натощак до (20-я неделя) и после (21 + 5-я недели) диетического вмешательства. C) Жировая масса в граммах, измеренная с помощью магнитно-резонансной томографии в указанные моменты времени после диетического вмешательства. D) Оценка активности НАЖБП, разделенная на степень стеатоза печени (0–3), воспаление (0–2) и гепатоцеллюлярный баллон (0–3), оцененные путем слепой гистологической оценки ткани печени, окрашенной H&E. E) Типичное окрашивание H&E ткани печени из указанной экспериментальной группы. F) Количество липидных капель в каждом из 3-4 образцов печени на экспериментальную группу, определенное количественно окрашиванием Oil Red O. G) Средний размер липидных капель в каждом из 3-4 образцов печени на экспериментальную группу, количественно определяемый окрашиванием Oil Red O. H) Распределение размера липидных капель в% от всех липидных капель в каждой экспериментальной группе. I) Концентрация адипонектина в плазме у мышей, голодавших в течение 5 часов, до (20-я неделя) и после (21 + 5-я недели) диетического вмешательства. J) ITT после четырех недель диетического вмешательства (21 + 4 недели). K) Экспрессия ключевых метаболических ферментов в ткани печени после пяти недель диетического вмешательства (недели 21 + 5) с помощью RT-qPCR. B + I) n = 6-9 на группу. Статистическая значимость обозначена * в парном t-тесте. D + K) n = 8-10 на группу. Статистическая значимость по сравнению с WD REF по критерию Краскела-Уоллиса, скорректированная с учетом множественных сравнений по апостериорной оценке Данна. F-H) n = 3 случайно выбранных образца на группу.Статистическая значимость по сравнению с WD REF по критерию Краскела-Уоллиса, скорректированная с учетом множественных сравнений по апостериорной оценке Данна. C + J) n = 9-10 на группу. Статистическая значимость по сравнению с WD REF с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA-RM, скорректированного с учетом множественных сравнений по Даннету post hoc. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Затем мы оценили липидом печени с помощью масс-спектрометрии (МС / МС), чтобы выяснить, связано ли уменьшение НАЖБП с измененным липидным профилем.Путем сравнения WD McB и WD REF мы идентифицировали 57 и 279 дифференциально регулируемых пиков в режиме отрицательной и положительной ионизации соответственно (рис. 5A-B, S5A-B, все FDR <0,05). Из них наиболее классифицированные липиды были заменены на WD McB в направлении мышей, получавших LFD (рис. 5C-D). Примечательно, что 57% видов с повышенной регуляцией были жирными кислотами с нечетной цепью, в то время как 80% видов с пониженной регуляцией представляли липиды с четным числом атомов углерода (рис. 5C-D и таблица S4), что подтверждает предыдущие отчеты, где нечетная, а не четная цепь. жирные кислоты обратно пропорциональны инсулинорезистентности человека 9 и диабету 2 типа 42 .

Рисунок 5: Кормление WD McB сбрасывает липидом печени и снижает иммунную инфильтрацию печени, облегчая НАЖБП:

A) Анализ основных координат (PCoA) липидов печени, идентифицированных в режиме отрицательной ионизации. B) То же, что и в A, но изображено на графике вулкана со значительно регулируемыми видами липидов (FDR <0,05), представленными по шкале log2 либо зеленым (WD McB > WD REF ), либо синим (WD McB < WD REF ). C-D) Идентифицированные виды липидов, дифференциально экспрессируемые (FDR <0,01) между WD McB и WD REF , как указано. Изменения складок и скорректированные значения p для отдельных видов липидов указаны в таблице S4. E) Пути Lipd, идентифицированные с помощью анализа кратности изменения, отделяющего группы LFD (серый) и WD McB (зеленый) от WD REF в режиме отрицательной ионизации. F) Уровни печеночных цитокинов TNF-α и IL-6, как указано. G) Ly6G + и CD3 + иммунные клетки, выявленные иммуногистохимическим методом. H) Уровни цитокинов в плазме IL-22, IL-18 и IL-17. F + H) n = 8-10. Статистическая значимость по сравнению с группой WD REF с помощью теста Краскела-Уоллиса, скорректированного с учетом множественных сравнений с помощью апостериорного анализа Данна. G) n = 3 на группу (выбранные случайным образом). Статистическая значимость по сравнению с WD REF с помощью однофакторного дисперсионного анализа, скорректированного для множественных сравнений методом Dunnett post hoc. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Чтобы оценить функциональные последствия изменения липидного профиля, мы использовали базу данных Lipidmaps для выявления затронутых путей и нанесли наблюдаемые изменения в шкалу log 2 , сравнивая LFD и WD McB с WD REF .Большинство пораженных путей аналогично регулировались как по направлению, так и по величине у мышей LFD и WD McB по сравнению с мышами WD REF (рис. 5E и S5C). Следует отметить, что желчные кислоты и церамиды, оба из которых были значительно подавлены у мышей, получавших WD McB , по сравнению с аналогами, получавшими WD REF , как было показано, опосредуют стеатогепатит за счет повышения уровня IL-6 и TNF-α, соответственно 43 , 44 . Поэтому мы измерили эти печеночные цитокины и наблюдали аналогичное снижение уровней как в LFD, так и в WD McB по сравнению с WD REF (рис. 5F).

Ключевой особенностью патологий печени, вызванных диетой, включая НАЖБП, является привлечение вновь активированных иммунных клеток, способных вызывать провоспалительный иммунный ответ. Этот процесс обычно затруднен у мышей, содержащихся в условиях умеренного теплового стресса, что, следовательно, не в состоянии фенокопировать патофизиологию человека. Однако термонейтральное содержание воспроизводит некоторые черты человеческого заболевания 45 , которые в сочетании с кормлением HFD усиливают внутрипеченочную инфильтрацию провоспалительных моноцитов Ly6 high 46 .Эти моноциты взаимодействуют с резидентными Т-клетками ткани и играют центральную роль в патогенезе повреждения печени, следовательно, представляют собой привлекательную терапевтическую мишень для смягчения развития НАЖБП и сокращения ассоциированных патологий 44 ​​.

Таким образом, мы подвергли ткани печени репрезентативных мышей иммунологической оценке с помощью иммуногистохимии и наблюдали заметное снижение как Т-клеток CD3 + , так и моноцитов Ly6 high у мышей, питающихся WD McB , по сравнению с их WD REF – скармливаемые аналоги (рис. 5G).Уменьшение печеночной иммунной инфильтрации отражалось повышенными уровнями циркулирующих IL-22, IL-18 и IL-17 у мышей, получавших WD McB , по сравнению с их аналогами, получавшими WD REF (рис. 5H, p <0,01, < 0,05 и <0,05 соответственно).

WD

McB кормление обращает вспять длительный микробный дисбактериоз кишечника и заметно улучшает выработку слизи в толстой кишке.

Улучшенный фенотип печени побудил нас к дальнейшему исследованию потенциальных признаков в оси кишечник-печень.Первоначально мы оценили, связаны ли наблюдаемые цитокиновые ответы с улучшением здоровья кишечника у мышей, содержащихся в T 30 ° C , где ожидается усиление воспаления 45 . Действительно, мыши, получавшие WD McB , были устойчивы к индуцированному WD укорочению толстой кишки, тесно связанному с воспалением толстой кишки (фиг. 6A).

Рисунок 6: Обработка WD McB улучшает выработку слизи в толстой кишке и обращает изменения микробиоты кишечника, вызванные ожирением, чтобы напоминать состав, обнаруженный у мышей, получавших худой LFD:

A) Длина толстой кишки в сантиметрах. B) Площадь нейтральных муцинов, определяемая окрашиванием периодической кислотой Шиффа (PAS) в трех конкретных местах, то есть в проксимальном, среднем и дистальном сегментах толстой кишки. В каждом образце (одна точка данных) в каждом месте были измерены три продольно разрезанных крипты. C) Глубина крипт толстой кишки (CD) в проксимальном, среднем и дистальном сегментах толстой кишки, измеренная на гистологических срезах. Измерения даны в мкм, а результаты представлены как средние по шести измерениям крипт на каждое местоположение на каждой отдельной мыши (3 продольно окрашенных PAS и окрашенных HID-AB крипты, соответственно, на каждую точку данных). D) Окрашивание PAS слизи в средних сегментах толстой кишки, репрезентативные гистологические срезы из трех экспериментальных групп, как указано. E) Область сульфомуцинов в проксимальном, среднем и дистальном сегментах толстой кишки по окрашиванию HID. В каждом образце и в каждом месте были измерены три крипты с продольным разрезом. F) Область сиаломуцинов в проксимальном, среднем и дистальном сегментах толстой кишки по окрашиванию AB. В каждом образце и в каждом месте были измерены три крипты с продольным разрезом. G) Типичное окрашивание HID-AB среднего сегмента указанной экспериментальной группы. H) PCoA состава фекальной микробиоты указанной группы до (21 + 0 неделя) и после (21 + 5) диетического вмешательства со средними значениями группы, указанными в виде центроидов. Состав микробиоты значительно отличался между группами WD REF и WD McB в конце 21 + 5-й недели эксперимента (PERMANOVA p = 0,001) I) TaxaСводка наиболее распространенных родов бактерий, показывающая среднюю относительную численность указанных родов. в каждой группе в указанный момент времени. J) Отношение Firmicutes / Bacteroidetes в образцах фекалий отдельных мышей при прекращении (21 + 5-я неделя). K) Deseq-анализ численности родов фекальных бактерий, значительно регулируемых вмешательством McB (p.adj. <0,05). Относительная численность в% в каждой группе и вариация показаны для каждого регулируемого рода в выбранные временные точки. Изменения складок и скорректированные значения p для отдельных родов указаны в таблице S5. A-K ) n = 8-10. A-C, E-J) Статистическая значимость по сравнению с группой WD REF с помощью однофакторного дисперсионного анализа или теста Краскела-Уоллиса (в зависимости от распределения Гаусса) с множественными сравнениями с помощью Даннета или post hoc Данна, соответственно.* = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Чтобы получить дополнительную информацию об иммуномодулирующих свойствах лизатов McB, мы сосредоточили внимание на производстве и функционировании слизи. Поскольку выработка муцина является конститутивным процессом, в котором секреция и прилипание постоянно происходят и быстро приспосабливаются к изменениям окружающей среды, иммуногистохимическая маркировка различных эпитопов MUC может не полностью воспроизводить физические свойства слизи. Поэтому мы применили специализированное гистохимическое окрашивание муцина, что позволило нам различать нейтральный и кислый муцины в соответствии с чистым зарядом каждой молекулы.Кислые муцины были далее разделены на сульфомуцины и сиаломуцины. Разделы показали, что регуляция нейтральных муцинов в бокаловидных клетках, находящихся в крипте, у мышей, получавших WD REF , последовательно снижалась по сравнению с аналогами, получавшими LFD, в трех четко определенных сегментах толстой кишки; то есть проксимальная, средняя и дистальная области (Рисунок 6B, D). Кормление WD McB не только полностью изменило эту картину во всех трех сегментах, но даже увеличило выработку нейтральных муцинов, превышающую уровни, обнаруженные у аналогов, получавших LFD.Это замечательное открытие, учитывая постоянное потребление западной диеты с высоким содержанием жиров и сахарозы, которые, как известно, препятствуют функции бокаловидных клеток. Затем мы оценили глубину крипты (CD) в окрашенных срезах. В то время как CD проксимальной и дистальной части толстой кишки в значительной степени не зависели от диеты, мы наблюдали повышенную CD в среднем сегменте мышей WD McB , которых кормили (рис. 6C). WD McB – кормление дополнительно усиливало паттерн гликозилирования, особенно в среднем сегменте толстой кишки, где эта группа демонстрировала 3-кратное увеличение сульфомуцинов, уравновешенное аналогичным (~ 2-кратным) снижением сиаломуцинов по сравнению с WD REF -кормленные мыши (рис. 6E-G).Никаких различий между мышами, получавшими WD REF и LFD, не наблюдалось, что указывает на то, что реципрокная регуляция статуса гликозилирования муцина была специфичной для кормления WD McB .

С акцентом на динамические взаимодействия между иммунитетом кишечника, гликозилированием муцина и комменсальными микробами 47 , мы затем оценили состав микробиоты кишечника в временно разделенных образцах. Это было сделано, чтобы определить, были ли изменения микробиоты кишечника, напоминающие микробиоту худых мышей, получавших LFD, были воспроизведены в этой усиленной установке.В отличие от первой серии экспериментов, в которых мы использовали спаренных мышей, демонстрирующих устойчивые профили микробиоты, теперь мы использовали одиночных мышей, чтобы исследовать, были ли опосредованные WD McB структуры сообщества достаточно устойчивыми, чтобы вызывать последовательные изменения в большей части тела. динамические сообщества одноквартирных мышей. Подобно нашим первым экспериментам при T 22 ° C , мы наблюдали нормализацию микробиома кишечника мышей, получавших WD McB , несмотря на длительное кормление WD до вмешательства (рис. 6H-K).Изменения, вызванные WD McB , на удивление согласуются с первой серией экспериментов, включая значительно более низкое соотношение F / B (рис. 6J и S5D) и существенное сокращение численности Desulfovibrio , которому противодействует аналогичное расцветание . Роды Parasutterella и Parabacteroides (Рисунок 6K, Таблица S5). Следует отметить, что возрастное увеличение численности Desulfovibrio , о котором недавно сообщалось, 30 было подтверждено в этом исследовании, где общая величина у мышей, получавших WD REF и LFD, увеличилась в 2-3 раза за 5 недель вмешательства (Рисунок 6K).Кормление WD McB полностью предотвратило эту траекторию, и парный анализ даже выявил пониженную относительную численность Desulfovibrio у этих мышей.

Обсуждение

В этом отчете мы исследовали взаимосвязь между пищевыми питательными веществами и взаимодействиями хозяина и микробов с акцентом на скорость иммунометаболического ответа в контексте кормления с высоким содержанием жиров и сахарозы. Мы обнаружили лизаты целых клеток из некомменсальных метанотрофных бактерий McB, способных полностью изменить характерные признаки кормления WD, несмотря на продолжающееся потребление диеты, вызывающей ожирение.Сигнатуры включали уменьшение жировой массы, улучшение кишечного иммунитета и глюкорегуляторной способности, сопровождаемые структурами микробного сообщества кишечника, напоминающими таковые у коллег, получавших постное питание LFD.

Недавно было показано, что аномальный состав микробиоты, связанный с ожирением, отражает потребление HFD, а не ожирение per se 48 . Поэтому стоит отметить, что нам удалось нормализовать дисрегулируемый микробиом кишечника у мышей, оставшихся на западной диете с высоким содержанием жиров и сахарозы; особенно с учетом того, что изменение жирных диетических привычек у людей с ожирением, связанных с образом жизни, остается клинической проблемой.Это замечательное изменение было воспроизведено в двух различных субштаммах мышей, происходящих от разных производителей, что подтверждает устойчивый фенотип, на который не оказывает заметного влияния исходный состав микробиоты. С этой целью в предыдущем отчете об устойчивом микробиоме приводились доводы в пользу длительной нормализации 49 . Это исследование показало, что мыши, переведенные на диету с низким содержанием жиров и клетчаткой после 12 недель кормления HFD, сместили их микробиоту в сторону контрольных мышей соответствующего возраста в течение 4 недель, но полностью сошлись только через 10 недель после изменения диеты.Это особенно интересно, поскольку пищевые волокна, как известно, являются наиболее мощным диетическим регулятором микробиоты кишечника 50 , намного превосходя диетический жир 51 . Тем не менее, в наших руках кормление WD McB смогло обратить вспять микробиом ожирения более быстрыми темпами, чем кормовая диета в предыдущем отчете 49 , несмотря на одинаковое содержание клетчатки в двух WD. Мы также показали, что изменение черт микробиоты воспроизводимо при различных температурах, изменении контрольных рационов, изменении продолжительности эксперимента и у мышей как в одном помещении, так и в одном помещении; все они являются известными модуляторами структур сообщества кишечной микробиоты.В то время как многие роды были одинаково затронуты между экспериментами, другие были либо регулируются исключительно при T 30 ° C (например, Bifidobacterium ) или менее выражены при T 30 ° C (например, Barnesiella ), что предполагает необязательность для эти специфические микробы в признаках метаболических заболеваний, наблюдаемых в этой модели. Аналогичные наблюдения были сделаны для Akkermansia , который был в ~ 3 раза активирован при T 30 ° C , но подвергся несогласованному воздействию (log2 FC отскакивал от +9.От 3 до -10,4) между двумя повторными исследованиями при T 22 ° C с выраженными внутригрупповыми вариациями.

В отличие от этих несоответствий, имело место последовательное подавление активности Desulfovibrio , сопровождаемое> 10-кратной активацией Parabacteroides и Parasutterella , что свидетельствует о том, что кормление WD McB питает благоприятную микробиоту, хотя механически описано. Тем не менее, недавно было показано, что Desulfovibrio процветает у старых мышей с ослабленным иммунитетом и ожирением с нарушенной регуляцией глюкозы 30 .Как потеря Т-клеток, так и введение Desulfovibrio per se вызвали инсулинорезистентность, вызванную ожирением 30 . Кроме того, было показано, что эта бактерия процветает в десульфированной слизистой оболочке толстой кишки, ассоциированной с колитом человека 52 и мыши 53 . В совокупности эти наблюдения подтверждают гипотезу о механистической связи между опосредованным WD McB снижением Desulfovibrio и наблюдаемыми улучшениями хемотипа муцина и скорости метаболического ответа.

Будущие исследования необходимы для выяснения того, были ли изменения кишечной микробиоты, наблюдаемые у мышей, получавших WD McB , результатом уникального источника питательных веществ, или этому способствовал WD McB , индуцированный p T regs . Следует отметить, что бокаловидные клетки, продуцирующие муцин, способны доставлять люминальные антигены к LP-проживающим дендритным клеткам (DC) 54 , способствующим поляризации Т-клеток 55 . Поскольку McB сильно индуцирует маркеры созревания DC in vitro – даже превосходя эффекты хорошо описанного пробиотического штамма, Escherichia coli Nissle 1917 56 – мы прогнозируем прямую связь между потреблением McB и соответствующим иммунным профилем.В дополнение к прямой связи, предложенной здесь, потребление McB может также косвенно способствовать поляризации T reg через расширенные SCFAs 57 . Эти важные метаболиты также поддерживают выработку слизи и способствуют взаимодействию тканей в оси кишечник-печень 2 . В соответствии с этим представлением мы наблюдали снижение уровней печеночных желчных кислот и TNF-α в сочетании с выраженным снижением внутрипеченочных CD3 + и Ly-6C high клеток. Важно отметить, что в то время как клетки Ly-6C high представляют провоспалительные, фиброгенные макрофаги 58 , их in situ дифференцируются в клетки Ly-6C low 59 способствуют восстановлению тканей и улучшают прогноз НАСГ 60 .Все упомянутые мишени предлагаются в качестве подходящих стратегий для сдерживания НАЖБП и более терминального заболевания печени, NASH 44 ​​.

Существенные, последовательные и глобальные изменения в иммунометаболическом профиле, обнаруженные в этом исследовании, указывают на клинический потенциал в случае их дальнейшего развития. Примечательно, что только в одном исследовании ранее удалось вызвать p T regs , и это было ограничено LI-LP 11 . Помимо индукции этой клеточной субпопуляции во всем желудочно-кишечном тракте, мы также показали, что эти клетки проявляли повышенную секреторную способность IL-17 у мышей, получавших WD McB , по сравнению с их аналогами, получавшими WD CNTL .С этой целью появляются новые данные, указывающие на то, что ненормативные аналоги p T regs , то есть T H 17 клеток, очищены от SI-LP у мышей DIO 14 и что повторное введение ex vivo дифференцировалось Тропные клетки кишечника T H 17 сдерживают развитие ожирения, тем самым улучшая чувствительность к инсулину 15 .

То, что IL-17 в этом вмешательстве продуцируется клетками T regs , а не T H 17, может дополнительно улучшить профиль безопасности предполагаемого лекарства, поскольку физиологическое воздействие и свойства клеток T H 17 зависят от контекста. -зависимый.Таким образом, клетки T H 17 могут усиливать воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) у людей с нарушенной барьерной функцией 61 , тогда как p T regs продемонстрировали повышенную подавляющую способность против того же заболевания 12 . Это уместная особенность, учитывая относительно высокую долю субъектов с метаболическими осложнениями, одновременно страдающих ВЗК 62 . Хотя наше исследование не было разработано для оценки восприимчивости к ВЗК, хорошо известно, что очищенные диеты нарушают барьерную функцию 50, 63, 64 и, таким образом, представляют клинические признаки ВЗК (причину заболевания), предшествующие воспалению (симптому) 65 .Поэтому стоит отметить, что помимо иммуномодулирующего фенотипа, кормление WD McB увеличивало выработку нейтральной слизи во всех сегментах толстой кишки, в то же время усиливая защитные от ВЗК сульфомуцины, особенно в среднем сегменте. В этом сегменте мы также обнаружили повышенный уровень CD у мышей, получавших корм McB, что в совокупности указывает на усиление барьерной функции.

Таким образом, это исследование демонстрирует последовательную активацию Foxp3 + RORγt + IL-17 + тройной положительный pT regs по всему желудочно-кишечному тракту и реверсию дисбактериоза кишечника в ответ на WD McB – кормление, даже в контексте высокого потребления жиров и сахарозы.Перспективы использования бактериальных лизатов в качестве альтернативы традиционным живым пробиотикам заслуживают дальнейшего изучения, так же как и будущие исследования, необходимые для оценки того, в какой степени наши результаты могут быть перенесены на людей. Также срочно необходимы дальнейшие исследования для определения биологической эффекторной молекулы (молекул), содержащейся в этом бактериальном лизате, что позволит впоследствии разработать универсальный медицинский продукт (ы), восстанавливающий баланс кишечного иммунитета и одновременно направленный на дисбактериоз кишечника и метаболические нарушения.

Дополнительная цифра S1: A) Taxasсводка наиболее распространенных бактериальных родов, показывающая среднюю относительную численность в% указанного семейства и родов в каждой группе в указанный момент времени. B) Deseq-анализ численности родов фекальных бактерий, значительно регулируемых вмешательством McB по сравнению с WD CNTL (p.adj. <0,05). Относительная численность в% в каждой группе и вариация показаны для каждого регулируемого рода в выбранные временные точки. Изменения кратности и скорректированные значения p для индивидуума указаны в таблице S3.

Дополнительная фигура S2: A) Стратегия гейтирования для врожденных лимфоидных клеток группы 3 (ILC3). Репрезентативные графики проточной цитометрии ex vivo стимулированных клеток тонкой кишки (SI) lamina propria (LP). ILC3 были гейтированы как отдельные живые клетки, линия 1 линия 2 CD90.2 + CD127int / + RORγδ + клеток. Показаны репрезентативные данные для RORγδ + ILC3s после стимуляции с (без) IL-23 или без него. Линия 1: CD11c, CD19, CD45R / B220, Ly-6G / Ly-6C (Gr-1), Ter119, NK1.1; Lineage2: CD3ε, CD8α, TCRβ, TCRγδ. B) Стратегия гейтирования для NK-клеток и Т-клеток. Репрезентативные графики проточной цитометрии ex vivo стимулировали клетки собственной пластинки толстой кишки. NK-клетки были гейтированы как одиночные, живые клетки, CD8α CD45 + NK1.1 + ; TCRγδ + Т-клетки были гейтированы как одиночные, живые клетки, CD8α CD45 + TCRγδ + CD4 ; CD4 + T H 1 клетки гейтировали как отдельные живые клетки, CD8α CD45 + TCRβ + CD4 + T-bet + IFNγ + ; Клетки CD4 + T H 17 были гейтированы как отдельные живые клетки, CD8α CD45 + TCRβ + CD4 + RORγδ + IL-17A + .Природные регуляторные Т-клетки ( n T regs ) были гейтированы как отдельные живые клетки, CD8α CD45 + TCRβ + CD4 + FoxP3 + RORγδ и периферически индуцированные регуляторные Т-клетки ( p T regs ) были гейтированы как отдельные живые клетки, CD8α CD45 + TCRβ + CD4 + FoxP3 + RORγδ + . Показаны репрезентативные данные TCRβ + CD4 + Т-клеток после стимуляции с или без (без) PMA и иономицина (PMA / Iono). C) Число клеток ILC3 в толстой кишке (LI) -LP и SI-LP. D) Номер ячейки NK1.1 в LI-LP и SI-LP. E) TCRγδ + CD4 количество клеток в LI-LP и SI-LP. C-E) Показаны отдельные значения из Exp1 (◆) и Exp2 (●) и статистически значимые различия с WD CNTL с помощью одностороннего дисперсионного анализа, скорректированного для множественных сравнений с помощью апостериорного анализа Даннета. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Дополнительная цифра S3: A-B) Значения глюкозы в крови и инсулина плазмы, соответственно, во время перорального теста на толерантность к глюкозе (OGTT) перед диетическим вмешательством (неделя 11).Среднее значение ± SEM показано для двух независимых экспериментов. C) Значения инсулина в плазме на 12 + 5 неделе OGTT представлены как среднее значение ± SEM двух независимых экспериментов. D) Безжировая масса в граммах в течение периода диетического вмешательства как среднее значение ± стандартная ошибка среднего из двух независимых экспериментов. A-D) Статистическая значимость по сравнению с WD CNTL с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA-RM, скорректированного с учетом множественных сравнений методом Dunnett post hoc. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Дополнительная цифра S4: A) Безжировая масса в граммах в течение периода диетического вмешательства как среднее значение ± SEM.Статистическая значимость по сравнению с WD REF с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA-RM, скорректированного с учетом множественных сравнений по Даннету post hoc. B) Увеличение массы тела; в течение первых 21 недели мышей кормили либо LFD, либо WD REF , как указано. Мышей, получавших WD REF , впоследствии разделяли на экспериментальные группы, кормили указанными диетами в течение дополнительных 5 недель. C) Конечная масса тела 21 неделя + 5. D) Суммарное потребление энергии в ккал на мышь во время диетического вмешательства (от 21 + 0 до 21 + 5 недель). C-D) Статистически значимые отличия от WD CNTL с помощью одностороннего дисперсионного анализа, скорректированного с учетом множественных сравнений с помощью апостериорного анализа Даннета. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Дополнительный рисунок S5: A) Анализ основных координат (PCoA) липидов печени, идентифицированных в режиме положительной ионизации. B) То же, что и в A, но изображено на графике вулкана со значительно регулируемыми видами липидов (FDR <0,05), представленными по шкале log2 либо зеленым (WD McB > WD Ref ), либо синим (WD McB < WD Ref ). C) Липидные пути, идентифицированные анализом кратности изменения, который отделяет группы LFD- (серый) и WD McB (зеленый) от WD Ref в режиме положительной ионизации. D) Соотношение Firmicutes / Bacteroidetes фекальных бактерий, отобранных до диетического вмешательства на 21 неделе + 0. Статистически значимые отличия от WD Ref с помощью одностороннего дисперсионного анализа, скорректированного с учетом множественных сравнений с помощью апостериорного анализа Даннета. * = p <0,05; ** = p <0,01 и *** = p <0,001.

Таблица S1: Экспериментальные диетические композиции

Состав экспериментальных диет, использованных в исследованиях, в% вес.Экспериментальные диеты были основаны на подобранном по партии белке WDNo с последующим добавлением казеина, масла макадамии и цельноклеточного лизата McB, как указано.

Таблица S2: Последовательности праймеров и температура отжига для кПЦР Таблица S3: Deseq-анализ из 12 + 6-недельных экспериментов

Результаты анализа deseq бактериальных родов в двух экспериментах, представленных на рис. 1 и S1, с указанием названия рода, складчатого изменения и Log2-кратного изменения. сравнение WD McB с WD CNTL . Не скорректированные значения p, а также значения p, скорректированные методом Бенджамини-Хохберга, сообщаются и статистически значимо затронуты роды (с поправкойp <0,05) выделены жирным шрифтом.

Таблица S4: Виды липидов, измененные McB:

Сообщенные p-значения по сравнению с WD REF получены анализом смешанных эффектов с множественными сравнениями и post hoc Даннета.

Таблица S5: Анализ Deseq из эксперимента 21 + 5 недель

Результаты анализа deseq бактериальных родов эксперимента 21 + 5 недель с указанием названия рода, Log2-кратное изменение, сравнение WD McB с WD REF . Не скорректированные значения p, а также значения p, скорректированные методом Бенджамини-Хохберга, сообщаются и статистически значимо затронуты роды (с поправкойp <0,05) выделены жирным шрифтом.

Сноски

  • ↵14 Эти авторы совместно руководили этой работой

  • Конфликты интересов BAHJ, JBH, ISL, KK, CRK и TEL являются соавторами Международной патентной заявки (PCT) № PCT / EP2018 / 071076 на основании прилагаемых данных.

  • Финансирование Эта работа была поддержана Норвежским исследовательским советом (проект 267655). B.A.H.J. была поддержана Lundbeck Foundation (номер гранта: R232-2016-2425) и Novo Nordisk Foundation (номер гранта: NNF17OC0026698).A-L.G. и А. были поддержаны Канадскими институтами кардиологических исследований и Sentinel North из фонда Canada First Research Excellence Fund.

МЕТРОПОЛИТАН БАНК События – mcb

  • Котировки Монитор
  • Zacks Research
    • Идеи акционерного капитала
    • Идеи ETF
    • Идеи взаимного фонда
  • График
    • Фундаментальная диаграмма
    • График производительности
    • Техническая карта
    • График трендов
  • Скрининг
    • Старые скринеры Zacks
      • Скринер акций
      • Проверка ETF
      • Проверка паевых инвестиционных фондов
  • Новости и события
    • Календарь событий
    • Экономический календарь
    • Новости
    • Сюрпризы активность
  • Конструктор таблиц
    • Построитель таблицы капитала
    • Построитель таблиц ETF
    • Построитель таблиц взаимных фондов
  • Служба поддержки
    • Руководства
    • Видеоуроки
    • Свяжитесь с нами
    • О нас
  • Авторизоваться
  • Ключевые характеристики
  • Цитата
  • Фундаментальная диаграмма
  • График производительности
  • Техническая карта
  • Zacks Research
  • Оценок
  • Quant модели
  • сверстников
  • Атрибуты
  • Новости
  • События
  • Финансы

Медицинский факультет Университета Вандербильта

Рейнфельд Б.И., Мэдден М.З., Вольф М.М., Хитил А., Бадер Дж. Э., Паттерсон А.Р., Сугиура А., Коэн А.С., Али А., До БТ, Мюир А., Льюис К.А., Хонго Р.А., Янг К.Л., Браун Р.Э., Тодд В.М., Хаффстатер Т. , Abraham A, O’Neil RT, Wilson MH, Xin F, Tantawy MN, Merryman WD, Johnson RW, Williams CS , Mason EF, Mason FM, Beckermann KE, Vander Heiden MG, Manning HC, Rathmell JC, Rathmell WK .Клеточно-запрограммированное распределение питательных веществ в микросреде опухоли. Nature [распечатка-электроника] . 2021 май; 593 (7858): 282-8. PMID: 33828302, PMCID: PMC8122068, PII: 10.1038 / s41586-021-03442-1, DOI: 10.1038 / s41586-021-03442-1, ISSN: 1476-4687.

Short SP, Pilat JM, Barrett CW, Reddy VK, Haberman Y, Hendren JR, Marsh BJ, Keating CE, Motley AK, Hill KE, Zemper AE, Washington MK, Shi C, Chen X, Wilson KT, Hyams JS, Denson Лос-Анджелес, Бурк РФ, Розен MJ, Уильямс CS .Селенопротеин Р, производный эпителием толстой кишки, является источником антиоксидантной защиты при раке, ассоциированном с колитом. Гастроэнтерология [распечатка-электроника] . 2021 апр; 160 (5): 1694-1708.e3. PMID: 33388316, PMCID: PMC8035252, PII: S0016-5085 (20) 35623-7, DOI: 10.1053 / j.gastro.2020.12.059, ISSN: 1528-0012.

Kilonzo VW, Sasuclark AR, Torres DJ, Coyle C, Pilat JM, Williams CS, , Pitts MW. Ювенильный дефицит селена ухудшает познавательную способность, сенсомоторную активацию и энергетический гомеостаз у мышей. Передняя гайка . 2021; 8: 667587. PMID: 34026810, PMCID: PMC8138326, DOI: 10.3389 / fnut.2021.667587, ISSN: 2296-861X.

Чокси Ю.А., Чапарро Дж., Бланко М., Шарда Р., Саркер С., Фергюсон С., Хиггинботэм Т., Хайремат Г., Реветта Ф., Вашингтон М.К., Уильямс К.С. , Ваези М.Ф. Импеданс и гистологические характеристики подгортанного пищевода позволяют отличить эозинофильный эзофагит от других заболеваний пищевода. Клин Гастроэнтерол Гепатол [распечатка-электроника] .2020 июл; 18 (8): 1727-1735.e2. PMID: 31589979, PMCID: PMC8019324, PII: S1542-3565 (19) 31081-X, DOI: 10.1016 / j.cgh.2019.09.032, ISSN: 1542-7714.

Hale AT, Brown RE, Luka Z, Hudson BH, Matta P, Williams CS , York JD. Модуляция метаболической токсичности ассимиляции серы преодолевает анемию и гемохроматоз у мышей. Adv Biol Regul [печатная версия] . 2020 Май; 76: 100694. PMID: 32019729, PMCID: PMC7230019, PII: S2212-4926 (20) 30005-1, DOI: 10.1016 / j.jbior.2020.100694, ISSN: 2212-4934.

Permar SR, Ward RA, Barrett KJ, Freel SA, Gbadegesin RA, Kontos CD, Hu PJ, Hartmann KE, Williams CS , Vyas JM. Обращение к трубопроводу врач-ученый: стратегии интеграции исследований в программы клинической подготовки. Дж. Клин Инвест . 2020 марта 02.03.2020; 130 (3): 1058-61. PMID: 32039914, PMCID: PMC7269558, PII: 136181, DOI: 10.1172 / JCI136181, ISSN: 1558-8238.

Short SP, Barrett CW, Stengel KR, Revetta FL, Choksi YA, Coburn LA, Lintel MK, McDonough EM, Washington MK, Wilson KT, Prokhortchouk E, Chen X, Hiebert SW, Reynolds AB, Williams CS .Kaiso необходим для MTG16-зависимого воздействия на карциному, ассоциированную с колитом. Онкоген [распечатка в электронном виде] . 2019 июн; 38 (25): 5091-106. PMID: 30858547, PMCID: PMC6586520, PII: 10.1038 / s41388-019-0777-7, DOI: 10.1038 / s41388-019-0777-7, ISSN: 1476-5594.

Short SP, Thompson JJ, Bilotta AJ, Chen X, Revetta FL, Washington MK, Williams CS . Серин треонинкиназа 17A поддерживает состояние эпителия в клетках рака прямой и прямой кишки. Mol Cancer Res [печатная версия] .2019 Apr; 17 (4): 882-94. PMID: 30655319, PMCID: PMC6941354, PII: 1541-7786.MCR-18-0990, DOI: 10.1158 / 1541-7786.MCR-18-0990, ISSN: 1557-3125.

Chen MS, Lo YH, Chen X, Williams CS , Donnelly JM, Criss ZK, Patel S, Butkus JM, Dubrulle J, Finegold MJ, Shroyer NF. Независимый от фактора роста 1 Является геном-супрессором опухоли при колоректальном раке. Mol Cancer Res [печатная версия] . 2019 Март; 17 (3): 697-708. PMID: 30606770, PMCID: PMC7387124, PII: 1541-7786.MCR-18-0666, DOI: 10.1158 / 1541-7786.MCR-18-0666, ISSN: 1557-3125.

Сковилл Э.А., Алламан М.М., Адамс Д.В., Мотли А.К., Пейтон С.К., Фергюсон С.Л., Хорст С.Н., Вильямс С.С. , Болье Д.Б., Шварц Д.А., Уилсон К.Т., Коберн Л.А. Полиненасыщенные жирные кислоты сыворотки коррелируют с сывороточными цитокинами и клинической активностью при болезни Крона. Научный сотрудник . 2019 27.02.2019; 9 (1): 2882. PMID: 30814550, PMCID: PMC6393448, PII: 10.1038 / s41598-019-39232-z, DOI: 10.1038 / s41598-019-39232-z, ISSN: 2045-2322.

Thompson JJ, Short SP, Parang B, Brown RE, Li C, Ng VH, Saito-Diaz K, Choksi YA, Washington MK, Smith JJ, Fingleton B, Brand T, Lee E, Coffey RJ, Williams CS . Вещество эпикарда кровеносных сосудов (BVES) снижает уровень рецептора LRP6 и цитоплазматического -катенина, чтобы модулировать передачу сигналов Wnt и гомеостаз кишечника. Канцерогенез [распечатка-электроника] . 2019 января 23.01.2019; PMID: 30689807, PMCID: PMC8067673, PII: 5299709, DOI: 10.1093 / carcin / bgz007, ISSN: 1460-2180.

Williams CS , Инесс А.Н., Барон Р.М., Аджихола О.А., Ху П.Дж., Вьяс Дж.М., Байоччи Р., Адами А.Дж., Левер Дж. Р., Заиди М. Подготовка врача-ученого: взгляды руководителей программ и начинающих молодых исследователей. JCI Insight . 2018.12.06.2018; 3 (23): PMID: 30518696, PMCID: PMC6328016, PII: 125651, DOI: 10.1172 / jci.insight.125651, ISSN: 2379-3708.

Коричневый RE, Короткий SP, Williams CS . Колоректальный рак и метаболизм. Curr Colorectal Cancer Rep [печатная версия] . 2018 Dec; 14 (6): 226-41. PMID: 31406492, PMCID: PMC66, DOI: 10.1007 / s11888-018-0420-y, ISSN: 1556-3790.

Short SP, Pilat JM, Williams CS . Роль селена и селенопротеина P в развитии, прогрессировании и профилактике кишечных заболеваний. Free Radic.Биол. Med [печатно-электронная] . 2018 01.11.2018; 127: 26-35. PMID: 29778465, PII: S0891-5849 (18) 30890-6, DOI: 10.1016 / j.freeradbiomed.2018.05.066, ISSN: 1873-4596.

Coburn LA, Singh K, Asim M, Barry DP, Allaman MM, Al-Greene NT, Hardbower DM, Polosukhina D, Williams CS , Delgado AG, Piazuelo MB, Washington MK, Gobert AP, Wilson KT. Потеря члена 2 семейства 7 переносчиков растворенных веществ усугубляет ассоциированный с воспалением туморогенез толстой кишки. Онкоген [распечатка в электронном виде] .2018.09.10.2018; PMID: 30202097, PII: 10.1038 / s41388-018-0492-9, DOI: 10.1038 / s41388-018-0492-9, ISSN: 1476-5594.

Choksi YA, Reddy VK, Singh K, Barrett CW, Short SP, Parang B, Keating CE, Thompson JJ, Verriere TG, Brown RE, Piazuelo MB, Bader DM, Washington MK, Mittal MK, Brand T, Gobert AP, Коберн Л.А., Уилсон К.Т., Уильямс CS . BVES требуется для поддержания целостности эпителия толстой кишки при экспериментальном колите путем изменения проницаемости кишечника. Mucosal Immunol [распечатка в электронном виде] . 2018 сен; 11 (5): 1363-74. PMID: 29

9, PMCID: PMC6162166, PII: 10.1038 / s41385-018-0043-2, DOI: 10.1038 / s41385-018-0043-2, ISSN: 1935-3456.

Brown JJ, Short SP, Stencel-Baerenwald J, Urbanek K, Pruijssers AJ, McAllister N, Ikizler M, Taylor G, Aravamudhan P, Khomandiak S, Jabri B, Williams CS , Dermody TS. Индуцированный реовирусом апоптоз в кишечнике. Установление кишечной инфекции. Дж.Вирол [электронная печать] . 2018 5/15/2018 мая; 92 (10): PMID: 29514905, PMCID: PMC58, PII: JVI.02062-17, DOI: 10.1128 / JVI.02062-17, ISSN: 1098-5514.

Blanchard M, Burton MC, Geraci MW, Madaio MP, Marsh JD, Proweller A, Rockey DC, Salata RA, Tan W, Williams CS , Zaidi M, Todd RF. Лучшие практики для программ обучения врачей-ученых: рекомендации Альянса академической внутренней медицины. Am. J. Med [печатная электроника] .2018 Май; 131 (5): 578-84. PMID: 29410155, PII: S0002-9343 (18) 30087-1, DOI: 10.1016 / j.amjmed.2018.01.015, ISSN: 1555-7162.

Сайто-Диас К., Беншабейн Х., Тивари А., Тиан А., Ли Б., Томпсон Дж. Дж., Хайд А.С., Сойер Л. М., Джодоин Дж. Н., Сантос Э, Ли Л. А., Коффи Р. Дж., Бошамп Р. Д., Уильямс К. С. , Кенуорти А. К. , Роббинс Д. Д., Ахмед Ю., Ли Э. APC ингибирует лиганд-независимую передачу сигналов Wnt по клатриновому эндоцитарному пути. Dev. Ячейка . 2018 марта 12.03.2018; 44 (5): 566-581.e8. PMID: 29533772, PMCID: PMC5884143, PII: S1534-5807 (18) 30108-4, DOI: 10.1016 / j.devcel.2018.02.013, ISSN: 1878-1551.

Томпсон Дж. Дж., Уильямс CS . Протеин-фосфатаза 2A в регуляции передачи сигналов Wnt, стволовых клеток и рака. Гены (Базель) . 2018.02.26.2018; 9 (3): PMID: 29495399, PMCID: PMC5867842, PII: genes21, DOI: 10.3390 / genes21, ISSN: 2073-4425.

Сковилль Е.А., Алламан М.М., Браун К.Т., Мотли А.К., Хорст С.Н., Уильямс С.С. , Кояма Т., Чжао З., Адамс Д.В., Болье Д.Б., Шварц Д.А., Уилсон К.Т., Коберн Л.А.Изменения липидного, аминокислотного и энергетического метаболизма позволяют отличить болезнь Крона от язвенного колита и контрольных субъектов по метаболомическому профилю сыворотки. Метаболомика [печатно-электронная] . 2018 Янв; 14 (1): PMID: 29681789, PMCID: PMC5

3, DOI: 10.1007 / s11306-017-1311-y, ISSN: 1573-3882.

Parang B, Thompson JJ, Williams CS . Эпикардиальная субстанция кровеносных сосудов (BVES) в соединительной передаче сигналов и раке. Тканевые барьеры [распечатка-электроника] .2018; 6 (4): 1-12. PMID: 30307367, PMCID: PMC6389126, DOI: 10.1080 / 21688370.2018.1499843, ISSN: 2168-8370.

McDonough EM, Barrett CW, Parang B, Mittal MK, Smith JJ, Bradley AM, Choksi YA, Coburn LA, Short SP, Thompson JJ, Zhang B, Poindexter SV, Fischer MA, Chen X, Li J, Revetta FL, Наик Р., Вашингтон М.К., Розен М.Дж., Хиберт С.В., Уилсон К.Т., Уильямс CS . MTG16 является опухолевым супрессором при колит-ассоциированной карциноме. JCI Insight [электронная распечатка] .2017.08.2017; 17.08.2017; 2 (16): PMID: 28814670, PMCID: PMC5621889, PII: 78210, DOI: 10.1172 / jci.insight.78210, ISSN: 2379-3708.

Short SP, Costacurta PW, Williams CS . Использование трехмерных органоидных культур для моделирования физиологии кишечника и колоректального рака. Curr Colorectal Cancer Rep [печатная версия] . 2017 июн; 13 (3): 183-91. PMID: 269, PMCID: PMC5736147, DOI: 10.1007 / s11888-017-0363-8, ISSN: 1556-3790.

Parang B, Kaz AM, Barrett CW, Short SP, Ning W, Keating CE, Mittal MK, Naik RD, Washington MK, Revetta FL, Smith JJ, Chen X, Wilson KT, Brand T, Bader DM, Tansey WP, Чен Р., Брентналл Т.А., Грейди В.М., Уильямс CS .BVES регулирует стабильность c-Myc через PP2A и подавляет индуцированный колитом опухолеобразование. Gut [распечатка-электроника] . 2017 Май; 66 (5): 852-62. PMID: 28389570, PMCID: PMC5385850, PII: gutjnl-2015-310255, DOI: 10.1136 / gutjnl-2015-310255, ISSN: 1468-3288.

Wang C, Gong G, Sheh A, Muthupalani S, Bryant EM, Puglisi DA, Holcombe H, Conaway EA, Parry NA, Bakthavatchalu V, Short SP, Williams CS , Wogan GN, Tannenbaum SR, Fox JG, Horwitz BH. Интерлейкин-22 управляет зависимым от оксида азота повреждением ДНК и дисплазией на мышиной модели рака, ассоциированного с колитом. Mucosal Immunol [распечатка в электронном виде] . 2017 2/15/2017; PMID: 28198364, PII: mi20179, DOI: 10.1038 / mi.2017.9, ISSN: 1935-3456.

Short SP, Williams CS . Селенопротеины в онкогенезе и прогрессировании рака. Adv. Cancer Res . 2017; 136: 49-83. PMID: 2

22, PMCID: PMC5819884, PII: S0065-230X (17) 30038-6, DOI: 10.1016 / bs.acr.2017.08.002, ISSN: 2162-5557.

Barrett CW, шорт SP, Williams CS .Селенопротеины и вызванный окислительным стрессом воспалительный онкогенез в кишечнике. Ячейка. Мол. Life Sci [распечатка-электроника] . 2016, 25 августа 2016 г .; PMID: 27563706, PII: 10.1007 / s00018-016-2339-2, DOI: 10.1007 / s00018-016-2339-2, ISSN: 1420-9071.

Barrett CW, Short SP, Choksi YA, Williams CS . Окрашивание пролиферации энтероидов целиком. Био Протокол . 2016, 20.06.2016; 6 (12): PMID: 29333475, PMCID: PMC5760989, DOI: 10.21769 / BioProtoc.1837 г., ISSN: 2331-8325.

Parang B, Bradley AM, Mittal MK, Short SP, Thompson JJ, Barrett CW, Naik RD, Bilotta AJ, Washington MK, Revetta FL, Smith JJ, Chen X, Wilson KT, Hiebert SW, Williams CS . Гены миелоидной транслокации по-разному регулируют программы колоректального рака. Онкоген [распечатка в электронном виде] . 2016.06.06.2016; PMID: 27270437, PII: onc2016167, DOI: 10.1038 / onc.2016.167, ISSN: 1476-5594.

Short SP, Whitten-Barrett C, Williams CS .Селенопротеин P при колит-ассоциированной карциноме. Моль Ячейка Онкол . 2016 May; 3 (3): e1075094. PMID: 27314080, PMCID: PMC42, PII: 1075094, DOI: 10.1080 / 23723556.2015.1075094, ISSN: 2372-3556.

Coburn LA, Horst SN, Allaman MM, Brown CT, Williams CS , Hodges ME, Druce JP, Beaulieu DB, Schwartz DA, Wilson KT. Доступность и метаболизм L-аргинина нарушаются при язвенном колите. Inflamm. Кишечник Дис [распечатка-электроника] . 2016 г., 21 апреля 2016 г .; PMID: 27104830, DOI: 10.1097 / MIB.0000000000000790, ISSN: 1536-4844.

Reddy VK, Short SP, Barrett CW, Mittal MK, Keating CE, Thompson JJ, Harris EI, Revetta F, Bader DM, Brand T, Washington MK, Williams CS . BVES регулирует программы кишечных стволовых клеток и жизнеспособность кишечных крипт после облучения. Стволовые клетки [распечатка-электроника] . 2016 г., 17 февраля 2016 г .; PMID: 268

, DOI: 10.1002 / stem.2307, ISSN: 1549-4918.

Паранг Б., Барретт CW, Уильямс CS .Модель рака, ассоциированного с колитом, AOM / DSS. Methods Mol. Биол . 2016; 1422: 297-307. PMID: 27246042, DOI: 10.1007 / 978-1-4939-3603-8_26, ISSN: 1940-6029.

Питтс М.В., Кремер П.М., Хашимото А.К., Торрес Д.Дж., Бирнс К.Н., Уильямс К.С. , Берри М.Дж. Конкуренция между мозгом и семенниками в условиях с пониженным содержанием селена: понимание половых различий в метаболизме селена и риска заболеваний нервной системы. Дж. Neurosci . 2015, 18.11.2015; 35 (46): 15326-38.PMID: 26586820, PMCID: PMC4649005, PII: 35/46/15326, DOI: 10.1523 / JNEUROSCI.2724-15.2015, ISSN: 1529-2401.

Уильямс CS , Бернард Дж. К., Демори Беклер М, Альмохази Д., Вашингтон М.К., Смит Дж. Дж., Фрей MR. ERBB4 сверхэкспрессируется при раке толстой кишки человека и усиливает клеточную трансформацию. Канцерогенез [распечатка-электроника] . 2015 июл; 36 (7): 710-8. PMID: 254, PMCID: PMC4572918, PII: bgv049, DOI: 10.1093 / carcin / bgv049, ISSN: 1460-2180.

Barrett CW, Reddy VK, Short SP, Motley AK, Lintel MK, Bradley AM, Freeman T, Vallance J, Ning W, Parang B, Poindexter SV, Fingleton B, Chen X, Washington MK, Wilson KT, Shroyer NF, Hill KE, Burk RF, Williams CS .Селенопротеин P влияет на индуцированный колитом онкогенез, опосредуя стволовость и окислительное повреждение. J. Clin. Инвест [распечатка-электроника] . 2015 01.07.2015; 125 (7): 2646-60. PMID: 26053663, PMCID: PMC4563672, PII: 76099, DOI: 10.1172 / JCI76099, ISSN: 1558-8238.

Poindexter SV, Reddy VK, Mittal MK, Williams AM, Washington MK, Harris E, Mah A, Hiebert SW, Singh K, Chaturvedi R, Wilson KT, Lund PK, Williams CS . Транскрипционный корепрессор MTG16 регулирует пролиферацию крипт тонкой кишки и регенерацию крипт после радиационного повреждения. Am. J. Physiol. Гастроинтест. Liver Physiol [печать в электронном виде] . 2015 марта 15 марта 2015 г .; 308 (6): G562-71. PMID: 25573176, PMCID: PMC4360050, PII: ajpgi.00253.2014, DOI: 10.1152 / ajpgi.00253.2014, ISSN: 1522-1547.

Parang B, Rosenblatt D, Williams AD, Washington MK, Revetta F, Short SP, Reddy VK, Hunt A, Shroyer NF, Engel ME, Hiebert SW, Williams CS . Корепрессор транскрипции MTGR1 регулирует выделение секреторной линии кишечника. FASEB J [печатная электронная версия] .2015 Март; 29 (3): 786-95. PMID: 25398765, PII: fj.14-254284, DOI: 10.1096 / fj.14-254284, ISSN: 1530-6860.

Parang B, Rosenblatt D, Williams AD, Washington MK, Revetta F, Short SP, Reddy VK, Hunt A, Shroyer NF, Engel ME, Hiebert SW, Williams CS . Корепрессор транскрипции MTGR1 регулирует выделение секреторной линии кишечника. FASEB J [печатная электронная версия] . 2015 Март; 29 (3): 786-95. PMID: 25398765, PMCID: PMC4763883, PII: fj.14-254284, DOI: 10.1096 / fj.14-254284, ISSN: 1530-6860.

Williams CS , Bradley AM, Chaturvedi R, Singh K, Piazuelo MB, Chen X, McDonough EM, Schwartz DA, Brown CT, Allaman MM, Coburn LA, Horst SN, Beaulieu DB, Choksi YA, Washington MK, Williams AD, Фишер М.А., Зинкель С.С., Пик Р.М., Уилсон К.Т., Хиберт С.В. MTG16 способствует целостности эпителия толстой кишки при экспериментальном колите. Gut [распечатка-электроника] . 2013 Октябрь; 62 (10): 1446-55. PMID: 22833394, PMCID: PMC3663894, PII: gutjnl-2011-301439, DOI: 10.1136 / gutjnl-2011-301439, ISSN: 1468-3288.

Сингх К., Коберн Л.А., Барри Д.П., Асим М., Скалл Б.П., Алламан М.М., Льюис Н.Д., Вашингтон М.К., Розен М.Дж., Уильямс К.С. , Чатурведи Р., Уилсон К. Делеция катионного переносчика аминокислот 2 обостряет колит, связанный с декстрансульфатом натрия, и приводит к Т-клеточному ответу с преобладанием ИЛ-17. Am. J. Physiol. Гастроинтест. Liver Physiol [печать в электронном виде] . 2013 1 августа 2013 г .; 305 (3): G225-40. PMID: 23703655, PMCID: PMC3742860, PII: ajpgi.00091.2013, DOI: 10.1152 / ajpgi.00091.2013, ISSN: 1522-1547.

Rosen MJ, Chaturvedi R, Washington MK, Kuhnhein LA, Moore PD, Coggeshall SS, McDonough EM, Weitkamp JH, Singh AB, Coburn LA, Williams CS , Yan F, Van Kaer L, Peebles RS, Wilson KT. Дефицит STAT6 уменьшает тяжесть оксазолонового колита за счет снижения экспрессии цитокинов, индуцирующих клаудин-2 и Th3. J. Immunol [электронная печать] . 2013 г., 15 февраля 2013 г .; 190 (4): 1849-58. PMID: 23303670, PMCID: PMC3563924, PII: jimmunol.1201373, DOI: 10.4049 / jimmunol.1201373, ISSN: 1550-6606.

Барретт К.В., Нинг В., Чен Х, Смит Дж. Дж., Вашингтон М.К., Хилл К.Э., Коберн Л.А., Пик Р.М., Чатурведи Р., Уилсон К.Т., Бурк Р.Ф., Уильямс К.С. . Опухолевая супрессорная функция глутатионпероксидазы gpx3 в плазме при колит-ассоциированной карциноме. Cancer Res [печатная электроника] . 2013, 01.02.2013; 73 (3): 1245-55. PMID: 23221387, PMCID: PMC3563732, PII: 0008-5472.CAN-12-3150, DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-12-3150, ISSN: 1538-7445.

Coburn LA, Horst SN, Chaturvedi R, Brown CT, Allaman MM, Scull BP, Singh K, Piazuelo MB, Chitnavis MV, Hodges ME, Rosen MJ, Williams CS , Slaughter JC, Beaulieu DB, Schwartz DA, Wilson KT. Высокопроизводительное мультианализируемое профилирование Luminex указывает на участие эотаксина-1 в язвенном колите. ПЛОС ОДИН . 2013; 8 (12): e82300. PMID: 24367513, PMCID: PMC3867379, PII: PONE-D-13-38373, DOI: 10.1371 / journal.pone.0082300, ISSN: 1932-6203.

Barrett CW, Singh K, Motley AK, Lintel MK, Matafonova E, Bradley AM, Ning W, Poindexter SV, Parang B, Reddy VK, Chaturvedi R, Fingleton BM, Washington MK, Wilson KT, Davies SS, Hill KE, Бурк РФ, Вильямс CS . Дефицит селена в пище усугубляет вызванное DSS повреждение эпителия и индуцированный AOM / DSS туморогенез. PLoS ONE [электронная печать] . 2013; 8 (7): e67845. PMID: 23861820, PMCID: PMC3701622, PII: PONE-D-13-14817, DOI: 10.1371 / journal.pone.0067845, ISSN: 1932-6203.

Коберн Л.А., Гонг Х, Сингх К., Асим М., Скалл Б.П., Алламан М.М., Уильямс К.С. , Розен М.Дж., Вашингтон М.К., Барри Д.П., Пиазуэло МБ, Касеро Р.А., Чатурведи Р., Чжао З., Уилсон К.Т. Прием добавок L-аргинина улучшает реакцию на травмы и воспаление при колите с декстрансульфатом натрия. PLoS ONE [печатная электроника] . 2012; 7 (3): e33546. PMID: 22428068, PMCID: PMC3299802, PII: PONE-D-12-00729, DOI: 10.1371 / journal.pone.0033546, ISSN: 1932-6203.

Barrett CW, Smith JJ, Lu LC, Markham N, Stengel KR, Short SP, Zhang B, Hunt AA, Fingleton BM, Carnahan RH, Engel ME, Chen X, Beauchamp RD, Wilson KT, Hiebert SW, Reynolds AB, Уильямс CS . Kaiso направляет корепрессор транскрипции MTG16 к сайту связывания Kaiso в промоторах-мишенях. PLoS ONE [печатная электроника] . 2012; 7 (12): e51205. PMID: 23251453, PMCID: PMC3521008, PII: PONE-D-12-22965, DOI: 10.1371 / journal.pone.0051205, ISSN: 1932-6203.

Williams CS , Zhang B, Smith JJ, Jayagopal A, Barrett CW, Pino C, Russ P, Presley SH, Peng D, Rosenblatt DO, Haselton FR, Yang JL, Washington MK, Chen X, Eschrich S, Yeatman Т.Дж., Эль-Рифаи В., Бошамп Р.Д., Чанг М.С. BVES регулирует ЕМП в клетках рака роговицы и толстой кишки человека и подавляется метилированием промотора в колоректальной карциноме человека. J. Clin. Инвест [распечатка-электроника] . 2011 Октябрь; 121 (10): 4056-69. PMID: 218, PMCID: PMC3195453, PII: 44228, DOI: 10.1172 / JCI44228, ISSN: 1558-8238.

Барретт К.В., Финглтон Б., Уильямс А., Нинг В., Фишер М.А., Вашингтон М.К., Чатурведи Р., Уилсон К.Т., Хиберт С.В., Уильямс К.С. . MTGR1 необходим для канцерогенеза в мышиной модели карциномы, связанной с колитом AOM / DSS. Cancer Res [печатная электроника] . 2011 г., 15 февраля 2011 г .; 71 (4): 1302-12. PMID: 21303973, PMCID: PMC3150168, PII: 0008-5472.CAN-10-3317, DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-10-3317, ISSN: 1538-7445.

Русь П.К., Пино С.Дж., Вильямс К.С. , Бадер Д.М., Хазелтон ФР, Чанг М.С.Bves модулирует передачу сигналов, связанных с плотными контактами. ПЛОС ОДИН . 2011; 6 (1): e14563. PMID: 21283798, PMCID: PMC3024319, DOI: 10.1371 / journal.pone.0014563, ISSN: 1932-6203.

Hong SK, Chaturvedi R, Piazuelo MB, Coburn LA, Williams CS , Delgado AG, Casero RA, Schwartz DA, Wilson KT. Повышенная экспрессия и клеточная локализация сперминоксидазы при язвенном колите и взаимосвязь с активностью заболевания. Inflamm. Кишечник .2010 сен; 16 (9): 1557-66. PMID: 20127992, PMCID: PMC2894261, DOI: 10.1002 / ibd.21224, ISSN: 1536-4844.

Whittem CG, Williams AD, Williams CS . Моделирование колита у мышей с использованием декстрансульфата натрия (DSS). J Vis Exp . 2010; (35): PMID: 20087313, PMCID: PMC2841571, PII: 1652, DOI: 10.3791 / 1652, ISSN: 1940-087X.

Farmer TE, Williams CS , Вашингтон MK, Hiebert SW. Инактивация опухолевого супрессора p19 (ARF) влияет на пролиферацию и целостность кишечных эпителиальных клеток. J. Cell. Биохим . 2008 г., 15 августа 2008 г .; 104 (6): 2228-40. PMID: 18442038, PMCID: PMC3164503, DOI: 10.1002 / jcb.21779, ISSN: 1097-4644.

Moore AC, Amann JM, Williams CS , Tahinci E, Farmer TE, Martinez JA, Yang G, Luce KS, Lee E, Hiebert SW. Члены семейства генов миелоидной транслокации связаны с Т-клеточными факторами (TCF) и влияют на TCF-зависимую транскрипцию. Мол. Клетка. Биол [распечатка-электроника] . 2008 фев; 28 (3): 977-87. PMID: 18039847, PMCID: PMC2223385, PII: MCB.01242-07, DOI: 10.1128 / MCB.01242-07, ISSN: 1098-5549.

Martinez JA, Williams CS , Amann JM, Ellis TC, Moreno-Miralles I, Washington MK, Gregoli P, Hiebert SW. Делеция Mtgr1 сенсибилизирует эпителий толстой кишки к колиту, индуцированному декстраном сульфатом натрия. Гастроэнтерология . 2006 Aug; 131 (2): 579-88. PMID: 168

, PII: S0016-5085 (06) 01238-8, DOI: 10.1053 / j.gastro.2006.06.009, ISSN: 0016-5085.

Smith DS, Williams CS , Ferris CD.Диагностика и лечение хронического пареза желудка и хронической псевдообструкции кишечника. Гастроэнтерол. Clin. North Am . 2003 июн; 32 (2): 619-58. PMID: 12858609, ISSN: 0889-8553.

Aklog L, Williams CS , Byrne JG, Goldhaber SZ. Острая эмболэктомия легочной артерии: современный подход. Тираж . 2002 3/26 марта 2002 г .; 105 (12): 1416-9. PMID: 11

7, ISSN: 1524-4539.

Williams CS , Sheng H, Brockman JA, Armandla R, Shao J, Washington MK, Elkahloun AG, DuBois RN.Ингибитор циклооксигеназы-2 (SC-58125) блокирует рост установленных ксенотрансплантатов рака толстой кишки человека. Неоплазия . 2001 Sep; 3 (5): 428-36. PMID: 11687954, PMCID: PMC1506203, ISSN: 1522-8002.

Манн М., Шенг Х, Шао Дж., Уильямс CS , Писакан П.И., Сливковски М.Х., Дюбуа Р.Н. Нацеливание на пути циклооксигеназы 2 и HER-2 / neu подавляет рост колоректальной карциномы. Гастроэнтерология . 2001 Jun; 120 (7): 1713-9. PMID: 11375952, PII: S0016508501646870, ISSN: 0016-5085.

Williams CS , Watson AJ, Sheng H, Helou R, Shao J, DuBois RN. Целекоксиб предотвращает рост опухоли in vivo без токсичности для нормального кишечника: отсутствие корреляции между моделями in vitro и in vivo. Cancer Res . 2000, 11 ноября 2000 г .; 60 (21): 6045-51. PMID: 11085526, ISSN: 0008-5472.

Callejas NA, Boscá L, Williams CS , DuBOIS RN, Martín-Sanz P. Регулирование экспрессии циклооксигеназы 2 в гепатоцитах с помощью CCAAT / связывающих энхансер белков. Гастроэнтерология . 2000 Aug; 119 (2): 493-501. PMID: 104, PII: S0016508500494680, ISSN: 0016-5085.

Williams CS , Tsujii M, Reese J, Dey SK, DuBois RN. Циклооксигеназа-2 хозяина модулирует рост карциномы. J. Clin. Инвестировать . 2000 Jun; 105 (11): 1589-94. PMID: 10841517, PMCID: PMC300858, DOI: 10.1172 / JCI9621, ISSN: 0021-9738.

Шэн Х., Шао Дж., Диксон Д.А., Уильямс К.С. , Прескотт С.М., Дюбуа Р.Н., Бошан Р.Д.Трансформирующий фактор роста-бета1 усиливает индуцированную Ha-ras экспрессию циклооксигеназы-2 в эпителиальных клетках кишечника посредством стабилизации мРНК. J. Biol. Chem . 2000 марта 3/3/2000; 275 (9): 6628-35. PMID: 106, ISSN: 0021-9258.

Уильямс CS , Манн М., Дюбуа Р. Роль циклооксигеназ в воспалении, раке и развитии. Онкоген . 1999, 20 декабря 1999 г .; 18 (55): 7908-16. PMID: 10630643, DOI: 10.1038 / sj.onc.1203286, ISSN: 0950-9232.

Williams CS , Goldman AP, Sheng H, Morrow JD, DuBois RN. Сульфид сулиндака, но не сульфон сулиндака, подавляет рост колоректального рака. Неоплазия . 1999 Jun; 1 (2): 170-6. PMID: 10933052, PMCID: PMC1508136, ISSN: 1522-8002.

Уильямс CS , Шаттук-Брандт Р.Л., Дюбуа Р.Н. Роль ЦОГ-2 при раке кишечника. Заключение эксперта по исследованию наркотиков . 1999 Jan; 8 (1): 1-12. PMID: 159, DOI: 10.1517 / 13543784.8.1.1, ISSN: 1744-7658.

Goldman AP, Williams CS , Sheng H, Lamps LW, Williams VP, Pairet M, Morrow JD, DuBois RN. Мелоксикам подавляет рост клеток колоректального рака. Канцерогенез . 1998 Dec; 19 (12): 2195-9. PMID: 9886578, ISSN: 0143-3334.

Sheng H, Williams CS , Shao J, Liang P, DuBois RN, Beauchamp RD. Индукция циклооксигеназы-2 активированным онкогеном Ha-ras в фибробластах Rat-1 и роль пути митоген-активируемой протеинкиназы. J. Biol. Chem . 1998, 21 августа 1998 г .; 273 (34): 22120-7. PMID: 9705357, ISSN: 0021-9258.

Sheng H, Shao J, Williams CS , Pereira MA, Taketo MM, Oshima M, Reynolds AB, Washington MK, DuBois RN, Beauchamp RD. Ядерная транслокация бета-катенина в наследственных и канцерогенных аденомах кишечника. Канцерогенез . 1998 Apr; 19 (4): 543-9. PMID: 9600336, ISSN: 0143-3334.

Williams CS , Smalley W, DuBois RN.Использование аспирина и потенциальные механизмы профилактики колоректального рака. J. Clin. Инвестировать . 1997 г., 15 сентября 1997 г .; 100 (6): 1325-9. PMID:

96, PMCID: PMC508309, DOI: 10.1172 / JCI119651, ISSN: 0021-9738.

Zhang T, Nanney LB, Peeler MO, Williams CS , Lamps L, Heppner KJ, DuBois RN, Beauchamp RD. Снижение экспрессии рецептора трансформирующего фактора роста бета-типа II в аденомах кишечника мышей Min / + связано с повышенной экспрессией циклина D1 и циклин-зависимой киназы 4. Cancer Res . 1997 5 января 1997 г .; 57 (9): 1638-43. PMID:99, ISSN: 0008-5472.

Inoue I, Nakajima T, Williams CS , Quackenbush J, Puryear R, Powers M, Cheng T, Ludwig EH, Sharma AM, Hata A, Jeunemaitre X, Lalouel JM. Замена нуклеотидов в промоторе ангиотензиногена человека связана с эссенциальной гипертензией и влияет на базальную транскрипцию in vitro. J. Clin. Инвестировать . 1997 г., 4 января 1997 г .; 99 (7): 1786-97. PMID:

24, PMCID: PMC508000, DOI: 10.1172 / JCI119343, ISSN: 0021-9738.

Williams CS , Luongo C, Radhika A, Zhang T, Lamps LW, Nanney LB, Beauchamp RD, DuBois RN. Повышенный уровень циклооксигеназы-2 в аденомах мышей Min. Гастроэнтерология . 1996 Oct; 111 (4): 1134-40. PMID: 8831610, PII: S0016-5085 (96) 70083-5, ISSN: 0016-5085.

DuBois RN, Eberhart CF, Williams CS . Введение в эйкозаноиды и желудочно-кишечный тракт. Гастроэнтерол.Clin. North Am . 1996 Jun; 25 (2): 267-77. PMID: 72, ISSN: 0889-8553.

Williams CS , DuBois RN. Эндопероксидсинтаза простагландина: почему две изоформы ?. Am. J. Physiol . 1996 Mar; 270 (3, часть 1): G393-400. PMID: 8638704, ISSN: 0002-9513.

Hunt SC, Williams CS , Sharma AM, Inoue I, Williams RR, Lalouel JM. Отсутствие связи между геном эндотелиальной синтазы оксида азота и гипертонией.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.