Смотрите также

• 5. 0 1 отзыв

  1296 просмотров
  

• 5.0 1 отзыв

  2007 просмотров
  

• 3859 просмотров
  

• 5.0 2 отзыва

  5793 просмотров
  

• 4.5 2 отзыва

  8305 просмотров
  

• 5.0 1 отзыв

  10770 просмотров
  

САМОЛЕЧЕНИЕ МОЖЕТ НАВРЕДИТЬ ВАШЕМУ ЗДОРОВЬЮ

Саб симплекс (Sab simplex) — Инструкция к препарату

Препарат принимают внутрь.

Повышенное газообразование

Новорожденным и детям грудного возраста (до 1 года), находящимся на искусственном вскармливании, добавляют по 15 капель (0.6 мл) суспензии в каждую бутылочку с детским питанием. Препарат хорошо смешивается с другими жидкостями (в т.ч. с молоком). Саб Симплекс можно давать новорожденным перед кормлением с чайной ложки.

Детям в возрасте от 1 года до 6 лет назначают по 15 капель (0.6 мл) во время или после еды, и при необходимости дополнительно по 15 капель на ночь.

Детям в возрасте от 6 до 15 лет назначают 20-30 капель (0.8-0.12 мл), взрослым – 30-45 капель (1.2-1.8 мл). Разовую дозу принимают каждые 4-6 ч. При необходимости возможно повышение разовой дозы.

Саб Симплекс лучше всего принимать во время или после еды и, при необходимости, перед сном.

Длительность применения зависит от динамики жалоб. При необходимости возможна длительная терапия.

Перед применением следует активно встряхнуть флакон. Чтобы суспензия начала поступать из пипетки флакон следует перевернуть вверх дном и постучать по дну.

Подготовка к диагностическим исследованиям ЖКТ

Применение при подготовке к диагностическим исследованиям ЖКТ облегчается, если с флакона удалить пипетку.

Для подготовки к рентгенографии за день до исследования вечером следует принять 3-6 чайных ложек (15-30 мл) препарата Саб Симплекс.

Для подготовки к УЗИ рекомендуют принять 3 чайные ложки (15 мл) вечером за день до исследования и 3 чайные ложки за 3 ч до исследования.

Перед эндоскопией следует принять 0.5-1 чайную ложку (2.5-5 мл) и во время исследования через эндоскоп ввести дополнительно несколько миллилитров суспензии препарата.

Отравление моющими средствами

Доза препарата Саб Симплекс зависит от тяжести отравления. Минимальная рекомендованная доза составляет 1 чайную ложку (5 мл).

Использование аденоассоциированных векторов и векторов вируса простого герпеса для экспрессии нейронов in vivo у мышей

Abstract

Аденоассоциированные вирусы и вирус простого герпеса являются двумя наиболее широко используемыми векторами для экспрессии экзогенных генов in vivo . Успехи в разработке этих векторов позволили замечательный временной и пространственный контроль экспрессии генов. Это устройство предоставляет методы для хранения, доставки и проверки экспрессии аденоассоциированных вирусов и вирусов простого герпеса в мозге взрослых мышей.В нем также описаны важные соображения для экспериментов с использованием экспрессии in vivo этих вирусных векторов, включая выбор серотипа и промотора, а также время экспрессии. Предоставляются дополнительные протоколы, в которых описаны методы предварительных экспериментов по определению подходящих условий для доставки in vivo .

Ключевые слова: аденоассоциированный вирус , вирус простого герпеса, in vivo, , мозг, мышь

ВВЕДЕНИЕ

Это устройство обеспечивает базовый протокол для введения аденоассоциированного вируса или вируса простого герпеса в мозг мыши.Рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы (AAV) и вирусные векторы простого герпеса (HSV) являются наиболее часто используемыми векторами в литературе по нейробиологии в качестве механизма экспрессии экзогенных генов во взрослом мозге. Последние достижения в области разработки векторов позволяют эффективно доставлять трансгены in vivo специфичным для типа клеток и точно во времени образом. В этом блоке представлены протоколы суб-аликвотирования, доставки и проверки AAV и HSV у взрослых мышей.Базовый протокол 1 подробно описывает аликвотирование и хранение векторов. Основной протокол 2 описывает доставку вируса в мозг взрослой мыши. Наконец, основной протокол 3 описывает валидацию экспрессии AAV или HSV и подтверждение размещения в мозге мыши с использованием методов иммуногистохимического (IHC) и белкового (западного) иммуноблоттинга (см. Также Альтернативный протокол 1). Поддерживающий протокол 1 также включен и обсуждает начальные эксперименты, которые необходимо провести с новыми вирусными векторами для определения соответствующего объема инфузии и времени экспрессии.

БАЗОВЫЙ ПРОТОКОЛ 1

Подготовка аликвот и хранение вирусных векторов для использования

В этом протоколе подробно описан процесс подготовки субаликвот ранее произведенных AAV или HSV для хранения перед использованием in vivo . Разделение аликвот на более мелкие практические объемы сводит к минимуму вероятность повторных циклов замораживания-оттаивания, которые могут повредить качество вирусного препарата.

Материалы

Подготовленный вирус (AAV или HSV)

Обычно предоставляется основным предприятием или компанией в растворе глицерин / фосфатного буфера (PBS). Никакого дополнительного разведения не требуется, если только ранее не было определено для интересующего вас вируса. Для оптимальной производительности in vivo вирусы должны иметь минимальный титр 10 ¹¹ копий генома (GC) / мл и 3 × 10 ⁸ инфекционных единиц (МЕ) / мл для AAV и HSV, соответственно. Существует множество методов титрования, каждый из которых имеет соответствующую единицу (, например, , ГХ / мл, МЕ / мл, вирусные частицы / мл, множественность инфекции). Диапазон титров может обеспечить достаточную трансдукцию; однако экспериментальные соображения, такие как область мозга, выбор промотора и клеточный тропизм, могут влиять на трансдукцию независимо от титра.Для оптимальной практики каждый вирусный препарат следует тестировать эмпирически, чтобы определить требуемый титр для оптимальной трансдукции.

Wet Ice

Микроцентрифужная пробирка с низким связыванием (0,65–0,7 мл)

напр. , Corning Пластиковые микроцентрифужные пробирки с низким связыванием

Пипетщик и наконечники фильтра подходящего объема (0,2–2 мкл)

Штатив для пробирок × 2

Один постоянный штатив для удержания пробирок внутри колпака, один плавающий штатив для мгновенной заморозки

Этанол лабораторная ручка или маркер

Ванна сухого льда / этанола для мгновенного замораживания

Используйте слой сухого льда, покрытый 100% этанолом, для получения переохлажденного этанола, подходящего для мгновенного замораживания аликвотных пробирок.

Настольная микроцентрифуга (низкоскоростная)

ПРИМЕЧАНИЕ : Суб-аликвотирование проводят в вытяжном шкафу BSL-2, предназначенном для работы с вирусами, чтобы поддерживать чистое рабочее пространство и держать вирусные конструкции отдельно от других экспериментов. Большинство комитетов по безопасности считает AAV BSL-1, тогда как HSV почти всегда считается BSL-2. Риски безопасности можно дополнительно минимизировать, если всегда использовать средства индивидуальной защиты при обращении с вирусом. Сюда входят перчатки, лабораторный халат, покрытие для волос, покрытие для обуви, защитные очки и маска.Ознакомьтесь с требованиями вашего учреждения по работе с этими вирусами и следуйте всем рекомендациям.

Суб-аликвотирование вируса из запаса

1. Разморозьте по одной пробирке с запасом вируса на влажном льду.

   Действуйте быстро, чтобы вирус не оставался на льду надолго. Избегайте перемешивания. Проведите пальцем по экрану, чтобы перемешать и замедлить вращение, используя низкоскоростную настольную микроцентрифугу .

2. Пока вирус тает, подготовьте пробирки с низким связыванием. Четко промаркируйте пробирки с помощью ручки, устойчивой к этанолу, и оставьте открытыми в вытяжном шкафу.

3. Используйте устойчивые к аэрозолям наконечники для пипеток для суб-аликвотирования вируса. Объем вируса следует определять на основе обычного количества мышей, которое может быть обработано за один сеанс операции. Цель состоит в том, чтобы произвести аликвоты, которые будут полностью израсходованы в конце сеанса. Это сводит к минимуму повторяющиеся циклы замораживания-оттаивания и гарантирует, что одна и та же партия вируса будет использоваться в каждом наборе операций.

   Соответствующие объемы инфузии необходимо будет определить экспериментально для каждой области мозга и вируса.Предположите почти полное извлечение аликвоты при использовании надлежащих методов загрузки шприца и пробирок с низким связыванием .

4. Субаликвоты мгновенного замораживания путем помещения в частично погруженный штатив для пробирок в баню сухой лед / этанол.

5. Суб-аликвоты хранить при температуре −80 ° C до использования. В дни операции храните аликвоты при -20 ° C или на льду непосредственно перед использованием. Избегайте размораживания ненужных аликвот.

   Как правило, после использования рекомендуется утилизировать неиспользованный вирус.Ознакомьтесь с требованиями вашего учреждения по утилизации агентов BSL-2. Для аликвот с низким титром повторное замораживание при -20 ° C для повторного использования не рекомендуется. Однако можно подвергнуть аликвоты с высоким титром однократному повторному замораживанию без заметного снижения инфекционности .

ОСНОВНОЙ ПРОТОКОЛ 2

Стереотаксическая операция по доставке вируса в мозг мыши

Стереотаксическая хирургическая доставка AAV или HSV позволяет осуществлять регионально-специфичную вирусную трансдукцию и экспрессию экзогенных генов.Координаты многих интересующих областей в мозге взрослой мыши были опубликованы или могут быть определены эмпирически с использованием атласов мозга. Список стереотаксических координат для часто целевых областей мозга представлен в. Оптимальная трансдукция AAV в большинстве регионов обычно требует инфузии 0,5–1 мкл вируса со скоростью 0,05 мкл за 30 секунд с последующим постинфузионным периодом покоя. Для инфузий HSV рекомендуется 1-2 мкл вируса с той же скоростью инфузии (подробности см. В разделе «Комментарий – объем инфузии»).Медленная скорость доставки небольших объемов обеспечивает более однородную доставку вируса и снижает повреждение тканей. Период отдыха после инфузии помогает свести к минимуму распространение вируса вверх по следу иглы. Для более крупных регионов несколько инфузий могут быть доставлены на разные целевые сайты. Для всех инфузий in vivo необходимо вливать вирусы с высоким титром для обеспечения максимальной трансдукции. Этот протокол ориентирован на ручную инфузию вируса с использованием шприцев Hamilton, установленных на универсальном держателе.Другие ранее опубликованные протоколы касаются инфузии с насосом, автоматизированной технологии брегмы и стереотаксического бурения на установке. Следующий протокол описан для стандартной линии мышей (C57 / Bl6), но его можно использовать для любой интересующей линии мышей.

Таблица 1

Таблица 4.37.1 Часто используемые стереотаксические координаты

Область мозга	A / P	M / L	D / V	Угол	Примечания	Источник
Ядро ложа полоски terminalis	+0.14	± 0,9	-4,8 1	0	AAV5	Jennings et al. (2013)
Базолатеральная миндалина	-1,4	± 3,2	-3,6 2	0	AAV5	Ян Ли
9014	9014	2,7145 9014 Центральная миндалина −4,25 1	0	Координата D / V HSV относится к глубине иглы инжектора после канюляции	Crock et al. (2012)
Зубчатая извилина	−2,0	± 1,2	−2,4 1	0		Деррик Балу
Спинной гиппокамп 1,6 1	0	AAV 1, 2, 5, 6, 8, 9 с дифференциалом распространения	Aschaeur et al. (2013)
Габенула, боковая	−1,7	± 0,48	−3. 34 1	0	AAV	Stamatakis and Stuber (2012)
Инфралимбическая кора	+1,7	± 0,4	−2,6 3		AAV	стеклянный колпачок AAV Cho et al. (2013)
Медиальная префронтальная кора	+1,9	± 0,3	−2,5 2	0		Pascoli et al. (2012)
Прилежащее ядро ​​	+1.6	± 1,5	−4,4 1	10	AAV2 / 2	Smith et al. (2014)
Оболочка прилежащего ядра	+1,2	± 0,5	−4,9 1	0	Долгосрочный HSV, ретроградный	Одри Уэллс
орбиты	± 1,0	−1,7 / 2 3	0	AAV2 / 1, инъекции произведены на обеих глубинах	Hooks et al. (2013)
Префронтальная кора – дорсомедиальная	+0,8	± 0,3	-1,75 1	0	HSV	Vetere et al. (2011)
Префронтальная кора – вентромедиальная	+1,75	± 0,75	−4,75 1	15	Рекомендуется стеклянная пипетка	Макото Танигучи	± 0,4	−1,5 2	0	AAV5	Ян Ли
Стриатум	+0,9	± 1,5	−3,2 7 9014 1	−3,2 7 9014 1	2, 5, 6, 8, 9 с дифференциалом спред	Aschaeur et al. (2013)
Таламус – двигатель	−0,45	± 0,85	−3,25 3	0	AAV2 / 1	Hooks et al. (2013)
Таламус – сенсорный	−1,2	± 1,3	−2,75 3	0	AAV2 / 1	Hooks et al. (2013)
Вентральная тегментальная область	−3,2	± 0,4	−4,48 2	0	AAV5	Kupferschmidt et al. (2015)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы с использованием живых животных должны быть рассмотрены и утверждены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC). Операции должны выполняться только обученным персоналом и должны соответствовать правилам IACUC и другим институциональным правилам, касающимся благополучия животных, операций по выживанию и обращения с рекомбинантной ДНК и вирусными векторами.

Материалы

Мыши C57 / Bl6 в возрасте от 8 до 12 недель

Анестетик: кетамин (16 мг / кг массы тела) / ксилазин (120 мг / кг массы тела) в 0,9% (мас. / Об.) NaCl, стерильный фильтруют и хранят при комнатной температуре. Приготовьте раствор для инъекций в объеме 0,1 мл / 10 г массы тела, внутрибрюшинно (IP).

ПРИМЕЧАНИЕ: Агентство по борьбе с наркотиками (DEA) включило кетамин в список III в соответствии с Законом о контролируемых веществах. Использование этого агента требует регистрации в DEA, лицензирования аптечным советом вашего штата и возможных дополнительных требований, продиктованных вашим учреждением перед заказом и использованием. Обратите внимание, что кетамин может вызывать быстрые и стойкие поведенческие (антидепрессантные) эффекты у грызунов, что может усложнить дизайн эксперимента и интерпретацию данных.

70% этанольные тампоны

Бетадин раствор

2% лидокаин-HCl

Аликвоты вируса, хранящиеся при -20 ° C до использования (см. Основной протокол 1)

Тройная мазь с антибиотиком

Офтальмологическая мазь

Стерильный раствор для инъекций , предварительно нагретые до 37 ° C

25–50 нг / кг Атропин

Микроцентрифужные пробирки 1,7 мл, каждая из которых наполнена дистиллированной водой, 10% отбеливателем (мас. / об.), 70% этанолом (мас. / об.)

Dremel сверло с битом 0,9 мм

Иглы 26-G

Стереотаксическая рамка, оснащенная насадкой для мыши и ушными дужками или чашками

Стерилизованные хирургические инструменты

• Скальпель

• Пинцет, тупой и тонкий

• Маленькие зажимы «бульдог»

Острые ножницы, ушной пробойник, зажим для пальцев ног или другое оборудование для идентификации животных

Стерильная марля

Стерильные ватные палочки

5 мкл, шприц Hamilton Microliter, модель 85 с усиленным поршнем

30-33-G, съемная игла с малой втулкой, 1. 5 дюймов длиной

ПРИМЕЧАНИЕ : При нацеливании на некоторые области мозга (, например, , префронтальная кора) металлические иглы могут вызвать значительное повреждение тканей. Для деликатных или небольших участков рекомендуется использовать стеклянные пипетки. При использовании стеклянных пипеток важно снизить скорость инфузии, учитывая, что постоянная скорость через инжектор с меньшим диаметром отверстия приводит к повышенному гидравлическому давлению в месте инъекции.

Машинка для стрижки маленьких животных

Электрогрелка

Клетки для удержания с подкладкой из бумажных полотенец

Чистая клетка для содержания со свежим постельным бельем

Шприцы объемом 1 мл с иглами 26 или 30 G для введения лекарств

Нитки или зажимы для ран №7 и держатель

Vetbond или другой одобренный клей

Чистящая проволока 0.00350 дюйм. для очистки иглы 31 G

Тепловой стерилизатор

Форма хирургического отслеживания животных

Каждая форма должна включать демографическую информацию о мыши (вес, идентификатор), координаты (как для подтверждения ориентации, так и конечные координаты инфузии), объем введенного вируса и послеоперационные заметки.

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед инфузией необходимо проверить координаты и объем инфузии. См. Раздел «Поддержка протокола 1» для пилотных экспериментов.

Подготовьте рабочую зону

ПРИМЕЧАНИЕ. Фотография, на которой изображена рекомендуемая хирургическая установка, представлена ​​на.

• 1.

  Установите стереотаксический каркас в асептическом операционном поле.

• 2.

  Закрепите шприцы на универсальном держателе.

  • 2.1.

    Сориентируйте шприц так, чтобы цифры на дисплее были обращены вперед.

  • 2.2.

    Установите шприц параллельно держателю.

  • 2.3.

    Используйте ограничитель руки держателя, чтобы закрепить шприц.Затяните фиксатор на металлической части держателя шприца; Избегайте затягивания через стекло или соединение стекло / металл.

• 3.

  Загрузите иглы и наполните шприц дистиллированной водой.

  • 3. 1.

    Отвинтить корпус ступицы от установленного шприца.

  • 3.2.

    Вставьте чистую прямую иглу 30-33-G в ступицу и закрепите на шприце.

  • 3.3.

    Ослабьте гайку в верхней части держателя шприца, чтобы поршень мог свободно перемещаться.Всегда будьте осторожны с поршнем, чтобы не повредить его.

  • 3.4.

    Загрузите 70% этанол в шприц, погрузив кончик иглы в пробирку на 1,7 мл и медленно поднимая поршень.

  • 3.5.

    Следите за жидкостью, чтобы убедиться, что этанол поднимается чисто, без пузырьков или зазоров. Невозможность наполнения может быть связана с засорением иглы или неправильно установленным соединением игла-ступица. Осторожно открутите ступицу и установите на место.

  • 3.6.

    Вылейте весь этанол и тщательно промойте дистиллированной водой. Опять же, следите за водой, чтобы обеспечить равномерную загрузку без пузырьков.

  • 3,7.

    Слейте всю воду и загрузите заданный объем (обычно 3–4 мкл) и затяните гайку, чтобы ограничить движение поршня.

  • 3.8.

    Отвести игловодитель от рабочей зоны.

A. Рабочее место для стереотаксической хирургии.Б. Установленные шприцы. C. Крупный план установленных шприцев, чтобы выделить место крепления. D. Крупный план корпуса шприца, обратите внимание на дно поршня и линию жидкости.

Выполнение стереотаксической операции

БАЗОВЫЙ ПРОТОКОЛ 3

Подтверждение экспрессии вируса

Стереотаксическая доставка вирусных векторов позволяет прогнозировать динамику экспрессии экзогенных генов в целевых областях мозга мыши. Важно подтвердить, что вирусная трансдукция ограничивается желаемой областью, ограничивается соответствующим типом клеток и экспрессируется на эквивалентных уровнях.Наши лаборатории отдают предпочтение методам IHC для подтверждения размещения и экспрессии наших вирусов. Также включен альтернативный протокол для проверки с помощью вестерн-блоттинга. Для подтверждения могут использоваться другие методы, включая гибридизацию in situ для проверки рекомбинации или сверхэкспрессии, а также размещение, сортировку с помощью проточной цитометрии для подготовки образцов для количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) или вестерн-блоттинга, а также микродиссекцию с лазерным захватом для выделения ДНК или мРНК из областей мозга, трансдуцированных вирусами.Протоколы, детализирующие эти методы, широко доступны, и перед использованием их следует проконсультироваться.

Материалы

Фиксированный мозг, приготовленный с помощью перфузии 3% PFA или фиксации капли, замороженный и разрезанный на срезы размером 30–50 мкм, хранящийся в 1xPBS / 0,01% азиде натрия

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обнаружили, что капля фиксации мозга мыши в свежем 3% PFA в течение ночи достаточно для сохранения обнаруживаемых антителами сигналов EGFP в AAV-трансдуцированном прилежащем ядре. Условия фиксации должны быть оптимизированы для специфических антител и вирусов, чтобы обеспечить максимальную чувствительность обнаружения.

1X PBS

24-луночные планшеты

Чашка Петри 35 мм

Пипетка из отполированного пламенем стекла, имеющая форму крючка

Кисть с обрезкой

SuperFrost + Slides (Fisher, 12-550-15)

Покровное стекло микроскопа (покровные стекла) (Fisher, 12-545-M)

Контейнеры для слайдов

Штативы для слайдов

Растворы этанола (70%, 95%, 100% мас. / Об., Приготовленные в сверхчистой воде)

Citrosolve

Монтажная среда DPX (ОПАСНО)

Пластиковая пипетка для переноса

Карандаш

Блокирующий раствор для ИГХ (см. Реагенты и растворы)

Раствор первичных антител, разведенный до соответствующей концентрации в блокирующем растворе

Раствор вторичных антител, разведенный до соответствующей концентрации в блокирующем растворе

ПРИМЕЧАНИЕ : При регенерации растворов антител укажите 0.02% (мас. / Об.) Азида натрия для предотвращения роста бактерий.

Роторный шейкер или вращающаяся платформа

Контрольный раствор для окрашивания (DAPI или Hoescht)

Лист отслеживания размещения с изображениями коронарных срезов интересующей области мозга для отслеживания таргетинга

Воздействие первичных антител

• 1.

  Полоскание срезы из интересующей области в 1X PBS.

  • 1.1.

    Используя стеклянный крючок, перенесите срезы из чашки для хранения в 35-миллиметровую чашку Петри, заполненную 1X PBS.

  • 1.2.

    Используя стеклянный крючок, выберите срезы из интересующей области и перенесите в маркированный 24-луночный планшет, заполненный 0,5–1 мл 1X PBS.

  • 1.3.

    ПРИМЕЧАНИЕ. Фотография, содержащая стеклянный крючок, 24-луночный планшет, PBS и чашку Петри для шагов 1.1–1.3, предоставляется в .

    Материалы для базового протокола 3: проверка IHC

    A. Рабочее пространство для протокола IHC. По часовой стрелке слева направо: 24-луночный планшет, 1X PBS, контейнер для слайдов, штатив для слайдов, карандаш, покровные стекла и слайды, тонкая кисть и стеклянный крючок, чашка Петри, этанолустойчивый маркер.Не показано: одноразовая пипетка для переноса, раствор DPX Mountant и этанол B. Крупный план стеклянной пипетки с крючком и кистей с тонкой обрезкой.

  • 1.4.

    Промойте срезы 3 раза по 5 минут на промывку, перемещая их через лунки.

• 2.

  Блок-ломтики на 1 час в 1 мл свежеприготовленного блокирующего раствора.

• 3.

  Обработайте срезы первичным антителом.

  • 3.1.

    Перенесите срезы в лунку, содержащую соответствующее разведение первичных антител (0.75–1 мл / лунку).

    Цель состоит в том, чтобы использовать комбинацию первичных антител, подтверждающих область трансдукции. Это может быть достигнуто путем окрашивания на экспрессируемый вирусом флуорофор или на сверхэкспрессируемые белки или белковые метки. Цель состоит в том, чтобы максимизировать вашу способность обнаруживать трансдуцированные области, чтобы определить размещение и исключить мышей с неудачной или нецелевой экспрессией. Первоначально важно использовать TUNEL (или другой маркер гибели клеток) в качестве контрольного красителя. Хотя ожидается некоторое повреждение клеток в области следа иглы и инфузии, значительное перекрытие сигнала апоптоза с маркером трансдукции указывает на то, что трансдукция, опосредованная вирусным вектором, вызывает токсичность.Учитывая отсутствие токсичных вирусных генов в большинстве AAV и HSV, апоптоз может быть результатом сверхэкспрессии интересующего гена или очень высоких уровней экспрессии флуорофора. Рассмотрите возможность дальнейших экспериментов in vitro для оценки токсичности конструкции и изменения объема инфузии или продолжительности инфекции для уменьшения накопления флуорофора .

  • 3.2.

    Определите подходящее время воздействия, часто в течение ночи при 4 ° C.

  • 3.3.

    Осторожно встряхнуть при 4 ° C (при воздействии на ночь) или комнатной температуре в защищенном от света месте.

    Если будут использоваться дополнительные первичные антитела, промойте срезы 3 раза по 5 минут на промывку в 1x PBS между воздействиями .

Воздействие вторичных антител

• 4.

  Вымойте срезы 3 раза в 1X PBS, 5 минут на каждую промывку, перемещая лунки.

• 5.

  Экспонируйте срезы вторичным антителом.

  • 5.1.

    Перенесите срезы в лунку, содержащую 400–500 мкл соответствующего разведения вторичных антител.

  • 5.2.

    Образцы встряхивать в течение 1 часа при комнатной температуре в защищенном от света месте.

    Если будут использоваться дополнительные вторичные антитела, промойте срезы 3 раза по 5 минут на промывку в 1xPBS между воздействиями .

Контрастное окрашивание (дополнительно)

• 6.

  Приготовьте краситель DAPI или Hoescht (1: 5000, в 1X PBS).

• 7.

  Инкубируйте срезы в контрастном красителе 0,5 мл в течение 20 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте.

Монтаж

ПРИМЕЧАНИЕ. Фотография с материалами для монтажа представлена ​​в .

• 8.

  Наклейте слайды SuperFrost + карандашом.

  Карандаш должен использоваться для четкой маркировки слайдов, так как другие пишущие материалы будут удалены или повреждены в результате обезвоживания растворами этанола и цитросольва .

• 9.

  Перенесите ломтики в 35-миллиметровую тарелку, заполненную 1X PBS, с помощью стеклянного крючка.

• 10.

  Используя кисть с мелкой щетиной, перенесите срезы на предметное стекло, ориентированные спереди назад. Обратитесь к атласу мозга для этого шага.

  • 10.1. Поместите кисть в 1X PBS рядом с желаемым ломтиком. Мягкими перекатывающими движениями возьмите кусочек и нанесите на кисть. Перенесите кисть на слайд и осторожными перекатывающими движениями нанесите срез на слайд.
  • 10.2. Если нужно, смочите кисть, чтобы срез был сдвинут. Используйте жидкость, чтобы сориентировать ломтик, не дергая и не порывая.
  • 10,3. Перед укладкой следующего ломтика удалите излишки жидкости вокруг среза с помощью кимвипа. Избегайте чрезмерного смачивания слайда, так как это приведет к смещению ломтиков в желаемой ориентации.

    Альтернативный метод: полностью погрузите предметное стекло в воду и используйте кисть, чтобы нанести срезы на предметное стекло. Удалите предметное стекло из PBS после того, как все срезы на стекле, и используйте кисть для исправления окончательной ориентации .

  • 10.4. Дайте слайдам высохнуть в защищенном от света месте минимум на 30 минут

    При необходимости слайды можно оставить сохнуть на ночь .

Обезвоживание и нанесение покровного стекла

• 11.

  Все промывки и нанесение покровных стекол должны производиться в вытяжном шкафу.

• 12.

  Подготовьте контейнеры для предметных стекол с помощью следующих растворов:

  • 12.1. 70% (мас. / Об.) Этанол
  • 12.2. 95% (мас. / Об.) Этанол
  • 12.3. 100% (мас. / Об.) Этанол
  • 12.4. 3 контейнера с Citro-solution

• 13.

  Загрузите небольшое количество (6 или меньше) слайдов в пластиковую стойку этикеткой вверх.

  После обезвоживания важно быстро выполнить этапы монтажа. Ограничьте количество слайдов, обрабатываемых в любой момент времени, чтобы избежать высыхания или повреждения ломтиков .

• 14.

  Выполните серию промывок, перенося штатив для предметных стекол из каждого контейнера, используя следующий график:

  • 14.1. 70% этанол в течение 20 секунд
  • 14.2. 95% этанол в течение 20 секунд
  • 14.3. 100% этанол в течение 20 секунд
  • 14.4. Citro-Solve за 20 секунд
  • 14.5. Ситро-раствор за 1 мин
  • 14.6. Ситро-раствор 5 мин
  • 14.7. Следите за тем, чтобы все время стирки не превышало 10 минут.

• 15.

  Извлеките ползунок из контейнера для последней стирки и положите на бумажное полотенце.

• 16.

  Удалите по одному слайду за раз и удалите излишки Citro-решения на бумажном полотенце

  Очень важно избегать пересушивания слайдов. Убедитесь, что все предметные стекла закрыты покровными стеклами в течение 2 минут после удаления с последней стадии промывки.Лучше всего обрабатывать небольшое количество слайдов за раз, чтобы обезвоживание, промывка и закрытие покровных стекол занимали менее 12 минут в общей сложности .

• 17.

  С помощью пластиковой пипетки для переноса нанесите 3-4 капли монтажной среды DPX на поверхность скольжения.

• 18.

  Быстро поместите покровное стекло на один край области визуализации слайда и медленно, но неуклонно опускайте его. По возможности избегайте образования пузырей.

• 19.

  Храните предметные стекла в закрытом контейнере и дайте им высохнуть в течение ночи.

Визуализация

• 20.

  Обратитесь к атласу мозга мыши, чтобы определить целевую область.

• 21.

  Изображение на предметном стекле, оснащенном соответствующим образом оборудованным микроскопом.

• 22.

  Подтвердить экспрессию с помощью сигнала флуоресценции; подтвердить таргетинг, сравнив с изображениями атласа.

• 23.

  Логарифмическое нацеливание, степень экспрессии и общее состояние ткани.

• 24.

  Сделайте репрезентативные изображения распространения для всех вирусов и групп. Распространение вируса в разных конструкциях может быть разным, но для включения в эксперимент его необходимо согласовывать.

• 25.

  Обновите координаты по мере необходимости для улучшения прицеливания.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ПРОТОКОЛ 1

Подтверждение экспрессии вируса

Помимо подтверждения экспрессии в целевых областях мозга, методы вестерн-блоттинга могут использоваться для сравнения изменения экспрессии представляющих интерес белков после вирусно-опосредованная экспрессия генов.В этом альтернативном протоколе описаны общие методы получения и подготовки ткани из инфицированной мозговой ткани для вестерн-блоттинга и количественного определения белка с использованием двухцветной системы обнаружения LiCor Odyssey.

Материалы

Мыши с вирусно-трансдуцированной областью мозга

Гильотинные или одобренные острые ножницы для декапитации

Оборудование для диссекции

Тупые щипцы, тонкие щипцы, маленькие ножницы, губки, пробойники, лезвия для бритв и матрица мозга.Матрицы размером 1 мм или 0,5 мм доступны как в сагиттальной, так и в коронарной ориентации (, например, , корональная матрица для мыши высотой 1 мм, Roboz).

ПРИМЕЧАНИЕ : Пробойники для тканей можно приобрести (, например, , нейропанч в стиле NIH, Fine Science Tools) или сконструировать путем удаления скошенного края игл разного калибра с помощью небольшой пилы для дремеля.

Сухой лед

Влажный лед

Большие весовые лодочки или чашки Петри 35 мм

Алюминиевая фольга

Шприцы объемом 1 мл

Иглы 28-G

1X PBS

1.Микроцентрифужные пробирки на 7 мл (с маркировкой)

Буфер для лизиса сахарозы (см. Реагенты и растворы)

Ингибиторы протеаз, киназ и фосфатаз по мере необходимости

Образец продукта: мини-таблетки с ингибитором протеазы (Roche)

NaF (50 мМ) , Окадаиновая кислота (0,5–50 нМ), ортованадат натрия (1 мМ), pMSF (1 мМ)

Соникатор (палочка, , например, , ультразвуковой процессор Cole-Parmer)

MilliQ или другая сверхчистая вода

70% этанол (мас. / Об.)

Водяная баня, нагревательный блок или другое устройство, способное кипятить пробирки

Настольная центрифуга

Набор для анализа BCA или другого белка

Буфер для образцов белка (SAB)

Восстановитель, e .г. , β-меркаптоэтанол (β-ME) или дитиотреитол (DTT)

Система электрофореза SDS-PAGE

Система переноса вестерн-блоттинга

Инфракрасная система визуализации LiCor Odyssey

1X PBS

1X 9 TBS4-T

10% (мас. / об.) SDS

Дополнительно для диссекции:

• Дополнительные источники света

• Рассекающий микроскоп

ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы с использованием живых животных должны быть рассмотрены и утверждены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC).Обученный персонал в соответствии с процедурами, утвержденными IACUC и другими институциональными правилами, касающимися благополучия животных, должен проводить все вскрытия.

Подготовка рабочего места

• 1.

  Приготовьте одно большое прямоугольное ведро для льда, заполненное влажным льдом, и накройте рабочее пространство алюминиевой фольгой.

• 2.

  Подготовьте одно ведро для льда достаточного размера с сухим льдом. Убедитесь, что есть место для того, чтобы все образцы были полностью погружены в сухой лед.

• 3.

  Пометьте все пробирки идентификаторами области мозга и мыши, а также датой.

• 4.

  Заполните одну лодочку для взвешивания или чашку Петри 1X PBS со льдом. Это блюдо будет использоваться для промывания и охлаждения мозга перед введением в матрицу мозга.

• 5.

  Заполните две весовые лодочки 1X PBS. Храните эти лодки на рабочей поверхности из алюминиевой фольги ведра для льда. Поместите матрицу мозга размером 1 мм матричной стороной вниз, погруженную в PBS одной лодки.Другая лодка будет использоваться для сбора срезов, полученных из матрицы, и ткани.

• 6.

  Разверните бритвенные лезвия, установите пробойники на шприцы со скользящими наконечниками на 1 мл и расположите все оборудование для препарирования в пределах легкой досягаемости.

Быстрое обезглавливание и сбор тканей

• 7.

  Быстро обезглавьте мышь в соответствии с правилами IACUC вашего учреждения.

• 8.

  Быстро удалить весь мозг.

  • 8.1.

    Обрежьте кожу головы, чтобы обнажить череп.

  • 8.2.

    Переверните голову вверх дном и сделайте три небольших надреза на черепе вокруг ствола мозга. Цель этих разрезов – сломать череп на дорсальной поверхности без повреждения головного мозга. Один разрез должен быть сделан с обеих сторон медиально / латерально от ствола головного мозга, а последний разрез должен быть сделан в задней части. Этот разрез должен в идеале треснуть череп до межпариетального шва.

  • 8.3.

    Поверните головку правой стороной вверх и найдите трещину в меж теменной кости, образовавшуюся в результате разреза. Используя тупой пинцет, потяните вверх теменную кость в сагиттальном шве, чтобы удалить череп. Снимите, потянув прямо вверх; Избегайте скручивающих движений, которые могут вбить фрагменты кости в ткань мозга.

  • 8.4.

    Обнажить мозг, удалив череп как можно дальше кпереди. Используя плоский шпатель, проведите по внешнему краю мозга, чтобы очистить кости и оторвать мозговые оболочки.Используя плоский шпатель, проведите под мозгом, чтобы оторвать его от черепа.

• 9.

  Поместите мозг в лодку для взвешивания, содержащую 1X PBS со льдом, и дайте отдохнуть в течение 1 мин.

• 10.

  Загрузите охлажденный мозг в матрицу мозга.

• 11.

  Закрепите мозг в матрице, поместив одно лезвие бритвы в переднюю часть мозга и осторожно продвигая вперед плоским шпателем, чтобы полностью закрепить мозг в матрице.Поместите второе лезвие бритвы в мозжечок, чтобы закрепить его.

• 12.

  Размещайте бритвенные лезвия через каждые 1 мм в интересующей области.

• 13.

  Осторожно извлеките бритвенные лезвия по одному. Срез ткани будет лежать на лезвии, перенесите ткань в весовую лодку, содержащую 1X PBS.

• 14.

  Определите срезы, которые содержат интересующую область, и рассмотрите интересующую ткань.

  • 14.1. Используйте тонкий пинцет для удаления более крупных участков, таких как образование гиппокампа или дорсальное полосатое тело.
  • 14.2. Воспользуйтесь тканевым перфоратором, чтобы удалить более мелкие области, такие как прилежащее ядро ​​или подобласти коры.
    • 14.2.1. Установите пробойник на шприц со скользящим наконечником объемом 1 мл. Заправьте шприц, набрав небольшой объем 1X PBS.
    • 14.2.2. Поместите пуансон на интересующую область и надавите. Поверните пуансон, осторожно вытягивая его до свободной области интереса, и втяните пуансон в шприц.

      Избегайте слишком сильного нажатия.Тонкостенные весовые лодочки легко проколоть, что приведет к дренажу PBS. В труднодоступных местах перед нанесением рассмотрите возможность использования пинцета для отделения пуансона от окружающей ткани.

• 15.

  Поместите ткань в пробирку с соответствующей этикеткой и удалите весь лишний раствор шприцем с тонким калибром.

  Удалите как можно больше PBS перед быстрой заморозкой на сухом льду. Оставшаяся жидкость повредит клеточные стенки и вызовет порчу образца ткани .

• 16.

  Поместите пробирки с тканями в сухой лед; убедитесь, что вся ткань погружена в сухой лед.

• 17.

  При необходимости собрать соответствующие контрольные регионы.

• 18.

  Ткань может храниться при температуре –80 ° C до готовности для приготовления лизата.

  Ткань, собранная таким образом, может быть обработана для получения лизата белка, как описано ниже, ИЛИ обработана для сбора мРНК .

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для немедленного взятия тканей после эвтаназии.В качестве альтернативы, неповрежденный мозг можно мгновенно заморозить с помощью сухого льда и ледяного изопентана после декапитации, хранить при -80 ° C и затем рассечь на криостате. Когда используется этот метод, образцы ткани собираются во время срезов. При отборе образцов в криостате убедитесь, что штампы ткани полностью высохли. Любая влага внутри быстро замерзнет и закроет пробойник. Образцы можно хранить при -80 ° C или сразу же помещать в буфер для лизиса (см. Раздел «Приготовление белкового лизата» ниже).

Приготовление белкового лизата

• 19.

  Приготовьте полный буфер для лизиса сахарозы, добавив ингибиторы до соответствующей рабочей концентрации.

• 20.

  Добавьте 50–200 мкл лизирующего буфера к каждому образцу.

  Добавляемый объем зависит от размера образца – например, 50 мкл для пробойника прилежащего ядра, 150 мкл для всего гиппокампа, 100 мкл для дорсального полосатого тела. В идеале объем должен покрывать ткань и обеспечивать достаточно места для полной обработки ультразвуком .

• 21.

  Ультразвуковая обработка образцов палочкой при низкой амплитуде (15–50%). Избегайте контакта с боковой стороной трубки. Обработка ультразвуком в течение 10 секунд на образец; Избегайте перегрева образца. Образцы можно обрабатывать ультразвуком в течение дополнительного времени после отдыха на льду.

• 22.

  Храните обработанные ультразвуком образцы на льду.

• 23.

  Очистите трубку, используя сверхчистую воду, 70% этанол и сверхчистую воду. Очистите между всеми образцами.

• 24.

  Образцы, обработанные ультразвуком, кипятили в течение 10 мин на водяной бане с температурой 98 ° C.

• 25.

  Охладите образцы на льду в течение 5 мин.

• 26.

  Образцы центрифугирования при 16000 × g в течение 10 мин при 4 ° C.

• 27.

  Подготовьте новые пробирки для всех образцов и храните на льду.

• 28.

  Перенести супернатант в предварительно охлажденные пробирки; будьте осторожны, чтобы не повредить гранулы.

• 29.

  Возьмите образец для анализа белка, храните остаток лизата при -80 ° C до определения концентраций.

  В качестве альтернативы образцы можно хранить на льду, пока определяется концентрация, если это можно сделать за короткий период времени .

• 30.

  Отрегулируйте концентрации всех образцов до равного количества с помощью буфера для лизиса и добавьте 4X SAB (вместе со свежим β-ME или DTT).

• 31.

  Варить образцы, содержащие SAB, при 98 ° C в течение 10 минут, центрифугировать 10 минут и хранить при –20 ° C.

Электрофорез и визуализация белка

• 32.

  Определите подходящую концентрацию SDS-PAGE для оптимального разделения интересующих белков.

  Обратитесь к альтернативным протоколам для более подробного обсуждения техники вестерн-блоттинга и соображений. Запустите и перенесите все гели для данного эксперимента, используя одни и те же настройки (концентрация геля, условия проведения и переноса, время воздействия антител), чтобы уменьшить вариабельность .

• 33.

  Загрузите равные количества лизата ткани путем нормализации общих концентраций белка для всех условий в одном и том же геле, если это возможно.

  Чередование экспериментальных и контрольных образцов при загрузке образца в дорожки .

• 34.

  Запустите гель при соответствующем напряжении в течение достаточного времени, чтобы максимально разделить интересующие полосы, как экспериментальные, так и контрольные.

• 35.

  Перенос белков на мембрану для воздействия антител.

  Рассмотрите возможность окрашивания гелей кумасси синим или мембран с помощью Ponceau после переноса, чтобы обеспечить полный перенос, и скорректируйте протокол переноса по мере необходимости для оптимизации эффективности .

• 36.

  Блокирующая мембрана на 1 час при комнатной температуре при легком встряхивании. Используйте 30 мл блокирующего буфера LiCor, разведенного 1: 1 в 1X PBS.

• 37.

  Промыть мембрану 3X в 1X TBS-T, 5 мин на промывку при легком встряхивании.

• 38.

  Воздействуйте на мембрану 30 мл раствора первичных антител, разбавленного до соответствующей концентрации в блокирующем буфере с добавлением 0,1% Твина-20. Определите время воздействия (см. Комментарий) и продолжайте накрывать и осторожно встряхивать в течение периода воздействия.

  Для белков с высоким содержанием, часто используемых в качестве контроля нагрузки (например, β-тубулина), время воздействия может составлять всего 30 минут при комнатной температуре. Для большинства экспериментальных белков стандартная выдержка составляет 1 час при комнатной температуре. Для белков с низким содержанием рассмотрите возможность инкубации в течение ночи (~ 16 часов) при 4 ° C с осторожным встряхиванием .

  Объемы можно регулировать в соответствии с размером исследуемой мембраны. Убедитесь, что все части мембраны полностью погружены, даже при встряхивании .

  В дополнение к зондированию с контролем нагрузки, если возможно, также включите контроль эффективности вирусной инфекции. Это лучше всего достигается путем блоттинга флуоресцентного белка (например, EGFP), если он включен в используемый вирусный вектор .

• 39.

  Восстановите раствор первичных антител и храните при 4 ° C.

• 40.

  Промывка мембраны 3 раза за 1 операцию TBS-T 5 мин на промывку при легком встряхивании.

• 41.

  Выполните дополнительное первичное экспонирование, необходимое для двухцветной системы обнаружения.Перед вторичным воздействием выполните этап промывки.

• 42.

  Подвергните мембрану 30 мл вторичного раствора, разбавленного до соответствующей концентрации в блокирующем буфере, и добавьте 0,1% (об. / Об.) Твин-20 и 0,01% (мас. / Об.) SDS для вторичного этапа.

  При использовании двухцветной системы обнаружения рекомендуется поместить наиболее распространенный белок (контроль загрузки) в канал 700 нм (красный).

• 43.

  Подвергните мембрану вторичному раствору в течение 1 часа при комнатной температуре при легком встряхивании.Убедитесь, что мембрана защищена от света.

• 44.

  Промывка мембраны 3 раза за 1 операцию TBS-T 5 минут на промывку при легком встряхивании.

• 45.

  Мембрана изображения согласно спецификации производителя.

• 46.

  Сканируйте свой блот белковой стороной вниз, влажной или сухой, прямо на поверхность для визуализации.

Количественная оценка и анализ белка

• 47.

  Нормализовать значения интенсивности полосы для контроля загрузки с той же дорожки.

• 48.

  Рассмотрите возможность повторной нормализации до маркера эффективности преобразования, если он доступен и подходит.

• 49.

  Сравните нормализованные значения, используя t-тесты или ANOVA, в зависимости от ситуации.

• 50.

  Рассмотрите возможность последующих исследований оставшегося лизата для изучения изменений в связанных белках или ожидаемых последующих изменений из-за экспрессии интересующей конструкции.

ПОДДЕРЖИВАЮЩИЙ ПРОТОКОЛ 1

Определение соответствующего объема инфузии вируса и динамики экспрессии

Вариабельность эффективности трансдукции векторов AAV является одним из следствий увеличения числа доступных комбинаций серотип / капсид.В то время как HSV демонстрируют устойчивый нейротропизм, другие факторы, такие как концентрация хелперного вируса и тип промотора, могут влиять на эффективность трансдукции этих векторов. Таким образом, для векторов AAV и HSV критически важно определить соответствующий объем инфузии и характер экспрессии конструкций до начала экспериментов по переносу генов, опосредованных вирусами. Этот протокол поддержки обеспечивает простую основу для разработки пилотных экспериментов для оптимизации использования любого типа вектора in vivo .

Материалы

• Аликвотированный вирусный вектор с высоким титром (см. Основной протокол 1)

• Стереотаксическое оборудование и животные (см. Основной протокол 2)

• Материалы для проверки экспрессии вируса ИГХ (см. Основной протокол 3)

Определение оптимального объема инфузии и динамики экспрессии

1. Инфузия различных объемов. Начните с шагом 0,1 мкл от 0,3–1,0 мкл (рекомендуется для AAV) и 0.5–2,0 мкл (рекомендуется для HSV), в зависимости от желаемого региона. Множественные независимые места инфузии предпочтительнее больших объемов инъекций при нацеливании на большую структуру (, например, , дорсальное полосатое тело) или несколько подобластей внутри одной и той же структуры (, например, , подразделения гиппокампа).

2. Различные объемы инфузий можно вводить с каждой стороны одной мыши, чтобы ограничить количество мышей, необходимое для пилотных экспериментов.

3. Создайте достаточное количество мышей для изучения экспрессии в нескольких временных точках.У большинства AAV будет максимальное инфицирование через 2–3 недели после заражения, в то время как HSV ассоциируется с пиковым инфицированием намного раньше, примерно через 3-5 дней после инъекции. В зависимости от плана эксперимента эти конкретные временные интервалы можно рассматривать как преимущество или ограничение векторов. Это обсуждается более подробно в разделе «Комментарии» (Предпосылки и время выражения и экспериментальный план).

4. Подтвердите пиковую экспрессию и продемонстрируйте поддержание экспрессии в моменты времени, выходящие за рамки предпочтительных экспериментальных сроков.Используйте протокол IHC, чтобы определить степень распространения и повреждения тканей введенным объемом.

5. Меньшие целевые объемы инфузии предпочтительнее объемов, которые заполняют интересующую область, но также производят нецелевую экспрессию. Идеальное соотношение включения: отклонения от цели должно быть значительно выше 75: 25% сигнала.

РЕАГЕНТЫ И РЕШЕНИЯ

IHC Blocking Solution

• 3% (мас. / Об.) Альбумин бычьей сыворотки

• 0,3% (об.) Triton-X100

• 0.2% (об. / Об.) Tween20

• 3% (об. / Об.) Нормальная сыворотка осла / козы

  ПРИМЕЧАНИЕ: сопоставьте сыворотку с видами, в которых было повышено вторичное антитело

• В 1X PBS

Сахароза Буфер для лизиса

• 5 мМ HEPES (pH 7,4)

• 1% (мас. / Об.) SDS

• 0,32 М сахароза

• в воде

Буфер для образца белка (ПРИМЕЧАНИЕ: отображается как 1X, готово как 4X)

Решения LiCor

• Блокирование: блокирующий раствор LiCor (LiCor, 927–40000) и 1X PBS в разведении 1: 1

• Первичные антитела: разбавленный раствор LiCor 1: 1 и 0.1% Tween-20

• Вторичные антитела: 1: 1 раствор LiCor, 0,1% Tween-20 и 0,01%

SDS

КОММЕНТАРИЙ

Общие сведения – Аденоассоциированные вирусы

Рекомбинантные адено- ассоциированные вирусы (AAV) обладают рядом свойств, которые делают их идеальными для использования в мозге взрослого человека. AAV представляют собой непатогенные парвовирусы, у которых естественная репликация недостаточна в отсутствие коинфекции хелпервируса (Berns and Giraud, 1996; Xiao et al., 1997). Инфекция AAV вызывает ограниченные иммунные ответы, и основа AAV практически не содержит токсичных вирусных генов (Kaplitt et al., 1994). AAV способны инфицировать широкие типы клеток, включая как делящиеся, так и неделящиеся клетки (Flotte et al., 1994; Podsakoff et al., 1994). После инфицирования клетки геном AAV сохраняется в клетках как эписомальные конкатемеры (Schnepp et al., 2003), конфигурация, которая поддерживает экспрессию вирусного генома в течение длительных периодов времени, ограничивая при этом геномную интеграцию.Эффективность трансдукции AAV частично зависит от конкретного типа капсидных белков, которые регулируют отбор рецепторов клеточной поверхности, которые задействованы для импорта в клетку. Подтипы AAV используют разные кэп-белки, вызывая различное сродство к конкретным типам клеток. В последние годы было идентифицировано все большее количество подтипов AAV, увеличивая комбинацию «псевдотипированных» (относящихся к конкретной комбинации инвертированных концевых повторов [ITR] и капсидных белков из разных серотипов) AAV, доступных для экспериментов (Xu et al. al., 2005; Cearley et al., 2008; Лю и др., 2008). Эти псевдотипы имеют разные клеточные тропизмы, и недавние исследования определили предпочтительные псевдотипы для разных областей мозга и типов клеток (Davidson et al., 2000; Rabinowitz et al., 2002; Wang et al., 2003; Cearley and Wolfe, 2006; Taymans et al., 2007; Aschauer et al., 2013; Watakabe et al., 2014a).

AAV являются подходящим вектором для множества применений, включая сверхэкспрессию или рекомбинацию, sh / siRNA-опосредованный нокдаун (RNAi) и отслеживание тракта.Основным ограничением использования AAV является их ограниченный размер конструкции. Из-за небольшой белковой капсулы AAV, встроенные конструкции ограничены размером 4,5–5,0 т.п.н. (Dong et al., 1996). Хотя это ограничение может мешать экспрессии больших белков, существует множество стратегий, разработанных для решения этой проблемы (см. Раздел «Критические параметры»).

Платформа AAV часто сочетается с системой Tet-ON или Tet-OFF, где один вектор содержит интересующий трансген под контролем чувствительного к tet-O промоторного элемента и второго конститутивного промотора, управляющего экспрессией трансактиваторного белка ( Le Guiner et al., 2014; Watakabe et al., 2014b). Недавно AAV были успешно использованы для целевого редактирования генов с использованием системы CRISPR / Cas9 (Swiech et al., 2015) и манипулирования нейрональной активностью с помощью оптогенетических конструкций (Gradinaru et al., 2010; Yizhar et al., 2011). В исследованиях отслеживания трактов и связности часто используются AAV с последовательностями DIO или FLEX, которые позволяют вводить AAV в области мозга с экспрессией трансгена под контролем активности рекомбиназы Cre (Wouterlood et al., 2014) или использовать преимущества различных серотипов AAV, которые демонстрируют надежные антеро- или ретроградный транспорт с различной степенью трансдукции порядка 2 ^и для определения связанных областей мозга (Salegio et al., 2012; Ротермель и др., 2013; Castle et al., 2014; Wang et al., 2014).

При правильном рассмотрении экспериментальных целей (см. Критические параметры и устранение неисправностей) AAV являются надежным методом долгосрочной экспрессии трансгенов in vivo . Платформа AAV имеет широкий спектр приложений, о чем свидетельствует их растущее использование в нейробиологических исследованиях.

Общая информация – Вирус простого герпеса

Многие из самых ранних исследований, в которых вирус-опосредованный перенос генов использовался для установления причинно-следственных связей между генами и поведением, были связаны с векторами ВПГ.ВПГ – нейротропные вирусы; как таковые, они могут надежно инфицировать как делящиеся, так и покоящиеся нейроны in vitro и in vivo (Lim, 2013). Это свойство HSV сводит на нет необходимость серо- или псевдотипирования для увеличения нейронального сродства (Lim, 2013) и позволяет переносить гены у видов, которые менее терпимы к другим формам вирусно-опосредованного переноса генов, например у рыбок данио (Zhu et al. ., 2009; Zou et al., 2014). Векторы

HSV обладают низкой цитотоксичностью и несут низкий риск инсерционного мутагенеза, поскольку их вирусный геном нелегко встраивается в хромосомы хозяина (Neve et al., 2005; Джерусалинский и Эпштейн, 2006; Джерусалинский и др., 2012; Лим, 2013). Существует три класса векторов HSV для доставки трансгенов: векторы с ослабленной репликацией, векторы с дефицитом репликации и векторы ампликона (Frenkel, 2006; Marconi et al., 2015). Геномные векторы HSV с ослабленной репликацией и с недостаточной репликацией содержат интересующий трансген, встроенный в вирусный геном, с целенаправленной делецией конкретных немедленных ранних (IE) генов, чтобы отключить литический цикл и сделать эти векторы нетоксичными (Wu et al., 1996; Krisky et al., 1998). Эти подтипы векторов подробно обсуждались в другом месте (Fink et al., 1996; Simonato et al., 2000; Mata et al., 2002; Goins et al., 2004). В центре внимания настоящего комментария находятся векторы ампликона: «пустые» плазмиды, содержащие мало или совсем не содержащие нативной вирусной ДНК (Neve et al., 2005). Ампликоны, возможно, являются наиболее пластичными векторами HSV из-за их небольшого размера плазмиды (5–10 т.п.н.), что делает возможным эффективное клонирование (Neve and Lim, 2013).

Исторически ограничение ампликонов ВПГ было требованием для вирусов-помощников, поскольку практически не было создано клеточных линий, экспрессирующих все необходимые белки для упаковки в частицы ВПГ (Spaete and Frenkel, 1982; 1985; Neve et al., 2005; Cuchet et al., 2007). Было показано, что даже вирусы-помощники с дефицитом репликации вызывают некоторую цитотоксичность (Neve and Lim, 2013), и исследования показывают, что чем больше количество делеций IE в вирусе-помощнике, тем ниже ожидаемый титр (Lim et al., 1996) . Однако прогресс в разработке векторов привел к появлению ампликонов с высоким титром и улучшенным соотношением ампликон / вирус-помощник (Neve and Lim, 2013), CRE-зависимых вспомогательных вирусов, дающих нетоксичные ампликоны (Logvinoff and Epstein, 2000; Zaupa et al., 2003) и вспомогательные безвирусные системы с использованием бактериальных искусственных хромосом для обеспечения генома HSV (Stavropoulos and Strathdee, 1998; Saeki et al., 1998; Horsburgh et al., 1999; Saeki et al., 2001).

Подобно AAV, потенциальные применения векторных систем HSV широки и включают сверхэкспрессию генов (Carlezon et al., 1997; Carlezon et al., 1998; Kelz et al., 1999; Carlezon et al., 2000; Pliakas et al., al., 2001; Rumpel et al., 2005; Gräff et al., 2014; Scobie et al., 2014), мутации, приводящие к потере функции (Han et al., 2008; 2007; Muschamp et al., 2011; Loweth et al., 2013) и siRNA-индуцированный нокдаун гена (Hong et al., 2006; Yang et al., 2011). Более того, HSV особенно хорошо подходят для отслеживания цепей, поскольку большинство подтипов переносчиков подвержены ретроградному транспорту (Norgren and Lehman, 1998). Несколько недавних отчетов продемонстрировали, что использование ретроградно транспортируемых HSV, экспрессирующих Cre-рекомбиназу, в сочетании с локальными инъекциями Cre-зависимых AAV, кодирующих канал или галлородопсин-2, позволяет оптогенетический контроль проекций нервных цепей (Jennings et al., 2013; Стаматакис и др., 2013; Сенн и др., 2014; Fenno et al., 2014). ВПГ

были эффективно использованы для доставки оптогенетических конструкций и конструкций DREADD (Covington et al., 2010; Christoffel et al., 2011; Ferguson et al., 2011; Michaelides et al., 2013) и особенно хорошо подходят для доставки большие конструкции из-за их выдающейся трансгенной способности – до 160 кБ (Saeki et al., 2001; Jerusalinsky, Epstein, 2006; Cuchet et al., 2007). Таким образом, ампликоны HSV могут вмещать большие или множественные трансгены вместе с их основными регуляторными последовательностями, улучшая физиологическую значимость манипуляций с переносом генов (Lim, 2013).Недавно система HSV была элегантно объединена с технологией Brainbow для отслеживания цепей (Zhang et al., 2015). В то время как конструкции AAV-Brainbow кодируют 1–4 оттенка (Cai et al., 2013), векторы HSV-brainbow, как было продемонстрировано, экспрессируют между 120–165 оттенками, маркируя отдельные нейроны с беспрецедентным разрешением (Zhang et al., 2015).

Большинство векторов ВПГ, особенно «первого поколения», имеют быстрые и преходящие профили инфицирования. Таким образом, они хорошо подходят для экспериментов, включающих повторное тестирование – экспериментов по «восстановлению», в которых поведенческие адаптации тесно связаны с повышением и понижением экспрессии трансгена, что позволяет элегантно продемонстрировать причинно-следственные связи.Они не являются идеальной платформой для исследований, требующих устойчивых, если не постоянных, изменений в экспрессии генов, которые лучше подходят для использования AAV (см. Сроки экспрессии и экспериментальный план). При правильном использовании оба типа векторов могут дать неоценимую дополнительную информацию о функциях мозга. Эти протоколы предназначены для использования в качестве руководства для исследователей, желающих ввести AAV или HSV в мозг взрослой мыши, и предоставить несколько методов для проверки степени инфицирования и экспрессии трансгена.

Критические параметры и устранение неисправностей

Дизайн конструкции

Наиболее важным параметром для использования вирусного вектора in vivo является конструкция самой конструкции. Хотя эти протоколы ориентированы на использование подготовленного вектора, этот раздел включает обсуждение основных соображений по проектированию вектора. ВПГ не требует псевдотипирования для увеличения нейротропизма, поскольку эти вирусы по своей природе нейротропны (Neve et al., 2005). AAV, с другой стороны, выигрывают от псевдотипирования.По мере увеличения числа отдельных идентифицированных подтипов AAV также увеличивается число доступных псевдотипов AAV. Правильный выбор используемых капсидных белков повлияет на относительный тропизм для определенных типов клеток и распространение вирусов в определенных областях мозга. Некоторые серотипы демонстрируют антероградный и / или ретроградный транспорт (, например, , AAV1, AAV8, AAV9), что делает их подходящими для отслеживания трактов, но потенциально усложняет эксперименты, требующие жесткого контроля региональной экспрессии.Результаты предыдущих публикаций, посвященных исследованию использования определенных серотипов AAV в мозге мышей, были подробно рассмотрены в других источниках (Davidson et al., 2000; Rabinowitz et al., 2002; Wang et al., 2003; Cearley and Wolfe, 2006; Taymans et al., al., 2007; Aschauer et al., 2013; Watakabe et al., 2014a).

Выбор промотора сильно влияет на то, какие клетки экспрессируют трансген и в какой степени он экспрессируется. Многие платформы AAV и HSV используют промоторы с высоким уровнем конститутивной активности, особенно CMV (цитомегаловирус) или родственный CAG (комбинация немедленного раннего энхансера CMV и промотора β-актина курицы) и промоторы IE4 / 5 и CMV для AAV. и HSV соответственно.Хотя эти промоторы производят высокие уровни экспрессии трансгена, они делают это независимо от типа клеток. Если требуется специфичность клеточного типа, использование промоторов, специфичных для широкого типа клеток, для ограничения экспрессии нейронами или глией (, например, , Synapsin-1, GFAP) или более ограниченных промоторов для специфической для нейрональных клеток экспрессии (, например, ). , TH, Emx1) значительно повысит селективность как AAV, так и HSV. Примечательно, что данные свидетельствуют о том, что использование нейрональных, а не вирусных промоторов в векторах HSV стимулирует более длительную экспрессию гена in vivo (Jin et al., 1996; Неве и др., 2005).

При использовании платформ AAV и HSV для экспрессии небольших некодирующих РНК (, например, , siRNA или shRNA) и / или экспрессии двух различных открытых рамок считывания, есть некоторые особые соображения. Для приложений, где желательна экспрессия shRNA, обычно используется промотор, который рекрутирует ферменты РНК-полимеразы III (, например, , h2 или U6). При конструировании конструкций с двумя промоторами использование двух разных промоторов может снизить конкуренцию промоторов за транскрипционный аппарат ( e.г. , клеточный тип, специфичный для трансгена, повсеместный промотор для флуорофора), но все же следует ожидать снижения экспрессии генов из обеих открытых рамок считывания.

Как отмечалось ранее, одним значительным ограничением AAVs является небольшой размер, доступный для встраивания трансгена (~ 4.5-5 kB между ITRs). Более крупные конструкции, содержащие промоторы, специфичные для клеточного типа и экспрессирующие несколько трансгенов вместе с их регуляторными элементами, лучше подходят для векторов HSV, которые могут вмещать ~ 160 килобайт.Однако многие группы успешно использовали доступное пространство в AAV для экспрессии как интересующего трансгена, так и неслитого флуорофора, используя либо внутреннюю последовательность входа рибосомы (IRES) (Atasoy et al., 2008; Gradinaru et al., 2010), либо конструкции с двумя промоторами 1. Другие методы решения проблемы ограничения размера AAV включают уменьшение размера кассеты экспрессии (Husain et al., 2009; Choi et al., 2014) или совместную доставку нескольких AAV, каждый из которых экспрессирует часть интересующий трансген (Ghosh et al., 2011; Palfi et al., 2012; Swiech et al., 2015).

Время экспрессии и план эксперимента

Тщательное рассмотрение плана эксперимента и желаемого графика экспрессии имеет важное значение при выборе вирусного вектора. Динамика вирусной экспрессии – одно из принципиальных различий между AAV и HSV. Экспрессия гена, опосредованная AAV, начинается медленно (~ 7–10 дней с пиком экспрессии через 2–3 недели) и сохраняется от месяцев до лет. С другой стороны, экспрессия генов, опосредованная HSV, начинается быстро (~ 12 часов), но обычно исчезает через ~ 8-10 дней.Таким образом, векторы HSV идеальны для экспериментов по «восстановлению», где потеря или усиление функции достигается за счет экспрессии генов, опосредованной вирусным вектором, но эффект является временным, что позволяет тестировать биологический эффект до, во время и после экспрессии интересующий белок. Однако важно отметить, что эти параметры экспрессии могут различаться для разных партий вируса, и важно тщательно проверять параметры экспрессии до выбора временных точек для повторного поведенческого анализа.Для этих анализов рассмотрите методы с чувствительностью для обнаружения экспрессии на более низких уровнях (, например, , qPCR, in situ, анализ ), которые будут способствовать обнаружению пред- или постпиковой экспрессии вируса.

В отличие от HSV, AAV более подходят, когда желательны длительные манипуляции с экспрессией генов. Из-за отставания в максимальной экспрессии и надежного восстановления взрослых мышей после описанных хирургических процедур, AAV предлагают уникальное преимущество перед HSV в том, что можно получить базовые показатели у субъектов после операции, но до экспрессии трансгена.Некоторые исследователи преодолели это очевидное ограничение ВПГ путем предварительной имплантации направляющих канюль в целевые области, что позволяет собирать исходные данные после операции, доставлять векторы бодрствующим или слегка анестезированным животным, быстро анализировать последствия измененной экспрессии генов и подтверждать их. восстановления, соответствующего потере экспрессии трансгена (Todtenkopf et al., 2006; Muschamp et al., 2011). Как и при планировании экспериментов с использованием AAV, важно определить параметры экспрессии, чтобы зафиксировать момент времени, на который минимально влияет хирургический стресс, но до начала вирусной экспрессии.

Следует отметить, что использование HSV и AAV не ограничивается короткими и длинными экспериментальными планами, соответственно. Например, включение конструкций Tet-ON или Tet-OFF в векторы AAV может обеспечить временный контроль экспрессии генов, опосредованной вирусным вектором. При надлежащем подтверждении активации трансгена субъекты могут быть повторно обследованы после индукции или подавления экспрессии. Параллельно с этим было предложено несколько стратегий для обеспечения пролонгированной HSV-опосредованной экспрессии гена, включая использование нейронального, а не вирусного промотора (Jin et al., 1996; Neve et al., 2005) и конструирование гибрида HSV-AAV (Fraefel et al., 1996; Johnston et al., 1997; Costantini et al., 1999). Кроме того, существует новая линия коммерчески доступных долгосрочных векторов HSV, которые стабильно экспрессируются до 28 дней in vivo (Jennings et al., 2013; Stamatakis et al., 2013; Yonehara et al., 2013). . Однако они подвержены устойчивому ретроградному транспорту и могут не подходить для экспериментов, предназначенных для поддержания экспрессии генов на региональном уровне в течение длительного времени.

Объем инфузии

Оптимальный объем инфузии вируса сильно зависит от типа вируса (, например, , AAV против HSV), титра, области мозга, промотора, серотипа / псевдотипа и вируса-помощника, если применимо. Таким образом, несмотря на наличие в литературе большой базы данных объемов инфузий в различные области мозга, чрезвычайно важно экспериментально определять необходимый объем инфузии каждый раз, когда исследуется новый вирус и / или область мозга.

Объем инфузии 0.Для экспрессии AAV в большинстве областей мозга рекомендуется 5–1 мкл, хотя сообщалось об объемах в десятки нанолитров. Для векторов ВПГ часто требуется существенно больший объем инфузии. В неопубликованной работе нашей лаборатории мы оценили экспрессию трансгена в VTA после инфузионных объемов HSV в диапазоне 1-2 мкл от титра полной концентрации (10 ⁸ МЕ / мл) и сравнили эти результаты с эффектами 1,0 мкл. или 2,0 мкл 50% разбавленного титра. Независимо от титра, экспрессия трансгена в пределах VTA была выше после 2.0 мкл относительно 1,0 мкл, микроинъекции HSV. Как и ожидалось, вирус с более высоким титром давал лучшую экспрессию, чем вирус с разбавленным титром. Однако объем инъекции был лучшим показателем экспрессии, чем титр. Эти данные могут указывать на то, что повышенный титр просто приводит к большему (асимптотическому) количеству трансдукций на клетку в пределах радиуса диффузии инъекции, который определяется объемом инъекции. Эта параметрическая работа иллюстрирует важность внутренней проверки оптимальных объемов инфузии до экспериментов.

Рекомендации по контролю

Учитывая диапазон возможных экспериментов, в которых можно использовать in vivo AAV- или HSV-опосредованную экспрессию гена, надлежащие меры контроля будут зависеть от конкретного эксперимента. Чрезмерная экспрессия одного или нескольких представляющих интерес генов является наиболее частым применением вирусных векторов. Часто самый простой контроль для этого типа экспериментов – это группа мышей с опосредованной AAV или HSV экспрессией флуоресцентного белка («пустой вектор») в одной и той же области мозга.Хотя этот дизайн эффективно контролирует неспецифические последствия хирургического вмешательства и микроинфузий вирусного вектора, существуют альтернативы. Конструкции для сверхэкспрессии часто используют два промотора для экспрессии интересующего гена и флуоресцентного белка. Конкуренция промоторов in vivo может приводить к снижению уровней экспрессии обеих частей по сравнению с одним промотором, управляющим флуорофором. Эксперименты часто включают использование либо нулевых версий интересующего гена, либо нефункционального белка аналогичного размера ( e.г. , LacZ, Люцифераза). Не менее популярным применением AAV, в частности, является Cre-опосредованная рекомбинация участков ДНК, фланкированных loxP, у генетически модифицированной мыши. Для этих экспериментов контроль «пустой вектор» является наиболее часто используемой контрольной группой, но также можно экспрессировать мутированную форму рекомбиназы Cre, которая не обладает ферментативной активностью и служит лучшим контролем. Кроме того, включение группы, получающей AAV-Cre, но не имеющей флоксованного аллеля, позволит выявить эффекты экспрессии Cre, опосредованные нерекомбинацией.В качестве положительного контроля для идентификации клеток, в которых, вероятно, произошла Cre-опосредованная рекомбинация, некоторые лаборатории использовали loxP-репортерную мышь, которая будет экспрессировать репортерный ген (, например, , EYFP или tdTomoato) после успешного Cre-опосредованного удаления скопированного транскрипционного стоп-кассету (Muzumdar et al., 2007). Другим распространенным применением как AAV, так и HSV является доставка in vivo конструкций shRNA или siRNA (RNAi) для нокдауна мРНК. Основным соображением в этих экспериментах является необходимость подтверждения того, что первичная мРНК-мишень, а не нецелевые эффекты, опосредуют интересующий фенотип.Существует ряд методов, которые можно использовать для демонстрации специфичных для мишеней эффектов, включая экспрессию двух или более shRNA, которые нацелены на уникальные части интересующей мРНК, чтобы продемонстрировать один и тот же фенотип, или спасение фенотипа путем одновременной экспрессии RNAi и экспрессии устойчивая к РНКи форма целевой мРНК. В дополнение к этим контрольным показателям специфичности РНКи очень важно иметь соответствующие отрицательные контроли для хирургического вмешательства и введения вируса. Вместо контроля «пустой вектор» отрицательные контроли для экспериментов с РНКи часто состоят либо из скремблированных последовательностей РНКи, либо из последовательностей-мишеней, направленных против негеномных последовательностей ( e.г. , LacZ или люцифераза).

Опосредованный вирусным вектором перенос генов для in vivo исследований имеет высокую скорость истощения экспериментальных данных. Мышей часто исключают из-за неправильного нацеливания или выражения, что увеличивает количество субъектов, которые необходимо создать. Это высокое истощение усиливает важность правильного планирования контрольных экспериментов с включением необходимых групп и тщательно изученных пилотных экспериментов на экспрессию и размещение, чтобы максимизировать полезность каждой созданной мыши.

Устранение неполадок, связанных с конкретным протоколом

Базовый протокол 1 – это простой протокол для определения и хранения коммерческих вирусов или вирусов, подготовленных в ядре. Существующие протоколы доступны для помощи исследователям в создании собственных векторов. Критически важно, чтобы вирусы хранились в пробирках с низким уровнем связывания, чтобы обеспечить максимальное восстановление объема, но, что более важно, чтобы избежать задерживания вирусных частиц в самой пробирке. Использование других пробирок приведет к снижению эффективности трансдукции из-за снижения титра вируса.

Basic Protocol 2 – это упрощенный протокол, описывающий стереотаксическую доставку вирусных векторов в мозг взрослой мыши. Основные проблемы, с которыми придется столкнуться во время стереотаксической хирургии, связаны с анестезией у мышей: либо до полноты, либо от выздоровления. Хотя мы описываем анестезию кетамином / ксилазином, исследователи могут рассмотреть возможность использования ингаляционных анестетиков (, например, , изофлуран), чтобы лучше контролировать степень и продолжительность анестезии. Кроме того, сейчас широко признано, что кетамин может вызывать стойкие поведенческие (антидепрессантные) эффекты, что может усложнять экспериментальный план и интерпретацию данных.Чтобы обойти эту проблему, рассмотрите возможность использования альтернативных хирургических анестетиков (, например, , изофлуран, пентобарбитал). При использовании кетаминовой / ксилазиновой анестезии рассмотрите возможность одновременного введения атропина (0,02–0,05 мг / кг, внутрибрюшинно), чтобы уменьшить накопление бронхиального секрета, который может вызвать затруднения дыхания. Кетамин / ксилазиновая анестезия может быть эффективно прекращена путем введения реверсивного агента, такого как α-2-адренергический антагонист атипамезол (1,0 мг / кг, внутрибрюшинно). Очень важно, чтобы реверсивные агенты использовались только в конце хирургической процедуры, потому что продолжительность анестезии будет значительно сокращена.Наиболее частая проблема, с которой сталкиваются при стереотаксической хирургии, – это неспособность точно нацелить интересующую область мозга. Первоначальные эксперименты с несколькими возможными целями помогут определить идеальные координаты, но нацеливание в конечном итоге определяется правильным размещением мыши в стереотаксической рамке. Обеспечение того, чтобы череп был «сплющен» перед наведением, является ключевым шагом в обеспечении точного достижения вычисленных координат. При измерении отклонений D / V от брегмы убедитесь, что стрелка находится под углом 0 °, и выполняйте измерения как в M / L, так и в A / P направлениях.Выберите места измерения, которые выходят за пределы вашего диапазона наведения (, например, , если координаты находятся на расстоянии 1,5 мм от брегмы, измерьте плоскостность на расстоянии 2 мм от брегмы). Помните, что небольшие отклонения в измерениях D / V проксимальнее брегмы будут усиливаться в более отдаленных местах. Попытайтесь пригладить мышь (при необходимости поднимая / опуская насадку для носа или ушную чашу) с точностью до 0,1 мм между измерениями. Иногда бывает необходимо полностью переустановить мышь, чтобы улучшить ориентацию. Забивание иглы – распространенная проблема в стереотаксической хирургии.Использование иглы меньшего диаметра и тщательная очистка или замена игл между мышами может помочь уменьшить эту проблему, хотя следует регулировать скорость инфузии при увеличении калибра (, т.е. , уменьшение диаметра отверстия) инжектора.

Basic Protocol 3 – это упрощенный протокол IHC-анализа экспрессии и размещения вируса. Важнейшие соображения в этом эксперименте включают использование конкретных первичных антител, оптимизацию времени воздействия антител и точный учет нацеливания.Этот протокол лучше всего работает с срезами толщиной 30–50 мкм; вариации толщины могут изменить рекомендации для этого протокола. С более тонкими секциями очень сложно работать, и их легко повредить при переносе с помощью стеклянных крючков. Для более тонких срезов использование сетчатых ячеек для удержания и переноса срезов во время промывки и воздействия антител может снизить риск повреждения. Сетчатые лунки, помещенные в 24-луночный планшет, потребуют дополнительного объема для полного погружения срезов. Также рекомендуется устанавливать более тонкие срезы, погружая предметное стекло (как указано в протоколе), а не наносить кистью.При использовании более толстых срезов проникновение антител через ткань (а также четкость изображения) может стать ограниченным. Увеличение продолжительности стадии пермеабилизации и увеличение концентрации первичного антитела иногда может улучшить проницаемость. По мере увеличения толщины среза будет увеличиваться и фоновая флуоресценция ткани, поэтому важно включать элементы управления «только вторичные» или «без антител», чтобы помочь отличить сигнал от шума. Доступны новые протоколы для улучшенной визуализации толстых срезов (Kupferschmidt et al., 2015) и может быть полезен для некоторых приложений.

Альтернативный протокол 1 – это стандартный протокол для сбора тканей и подготовки лизата. Часто встречающаяся проблема – низкий выход белка из определенных областей мозга. Чтобы улучшить концентрацию белка, рассмотрите возможность объединения двух полушарий и / или выполнения частичных разрезов из нескольких срезов размером 1 мм (или создания более толстых срезов). Альтернативы свежим субдиссекциям (, например, , штампы из замороженной ткани на криостате) здесь минимально обсуждаются, но существуют в других протоколах.В ходе вестерн-блоттинга может возникнуть множество проблем, и все они хорошо решены в альтернативных протоколах.

Ожидаемые результаты

Эти протоколы должны обеспечивать доставку и валидацию конструкций AAV или HSV в мозг мыши. В зависимости от рассмотренных ранее соображений (серотип / тропизм, выбор промотора, представляющий интерес трансген) стереотаксическая инфузия вируса с высоким титром должна вызывать устойчивую экспрессию в течение 2–3 недель и 3–5 дней после доставки для AAV и HSV, соответственно.Ожидается, что экспрессия AAV будет сохраняться в течение нескольких месяцев in vivo (McCown et al., 1996; Kaplitt et al., 1994), тогда как экспрессия HSV, за исключением недавно разработанных ретроградных векторов (которые имеют модифицированные промоторы, увеличивающие экспрессию до более 3 недель), как правило, не определяется в течение ~ 10 дней после трансдукции (Neve et al., 2005). Репрезентативные изображения экспрессии GFP с использованием AAV и ретроградного вектора HSV представлены в (A, B и C, D, соответственно). При правильном дизайне конструкции методы ИГХ и вестерн-блоттинга можно использовать для проверки экспрессии и, в некоторых случаях, для количественной оценки изменений, вызванных экспрессией трансгена.В зависимости от цели эксперимента (, например, , Cre-опосредованная рекомбинация, сверхэкспрессия гена, РНКи, доставка оптогенетических молекул и т. Д.) Потребуются различные стратегии контроля и проверки. Описанный Базовый протокол 3 (проверка с помощью ИГХ) подходит для приложений, в которых вирусная инфекция продуцирует (A) флуоресцентный белок или метку, подходящую для обнаружения антител, (B) нокдаун или нокаут большого количества белка доступным специфическим антителом, или (C) сверхэкспрессия интересующего гена, обнаруживаемая доступным специфическим антителом.Хотя подтверждение степени экспрессии лучше всего достигается с использованием неслитого флуоресцентного белка или другого маркера, можно использовать другие описанные ситуации для подтверждения степени экспрессии. Хотя здесь это не включено, в некоторых случаях процедуры ИГХ в сочетании с соответствующими протоколами визуализации и анализа могут использоваться для количественной оценки степени и / или локализации экспрессии трансгена. Альтернативный протокол 1 (количественная оценка вестерн-блоттингом) подходит для приложений, в которых целевая область мозга может быть точно получена путем вскрытия, а экспрессированный или сбитый трансген (или слитый тег) можно обнаружить с помощью доступного специфического антитела.В разделе сбора тканей Альтернативного протокола 1 производятся образцы, которые можно обрабатывать для сбора мРНК и количественной оценки количественной ПЦР, другого метода количественного определения уровня экспрессии трансгена или нокдауна / нокаута мРНК.

A. Сигнал AAV2-EGFP, окрашенный антителами, через 4 месяца после внутри-NAC инфузий 0,6 мкл вируса B с высоким титром. Сигнал AAV2-EGFP, окрашенный антителами, через 4 недели после внутри-НАК инфузии 0.6 мкл вируса с высоким титром. C. Минимальная экспрессия GFP в месте инъекции через 19 дней после инфузий внутри оболочки NAC долгосрочного ретроградно транспортируемого вектора HSV-GFP с использованием промотора TH. D. Устойчивая экспрессия GFP в VTA через 19 дней после инфузий TH-HSV-GFP в оболочку внутри NAc.

Вопросы времени

Для аликвотирования вируса, как описано в Основном протоколе 1, требуется примерно 30–45 минут, включая сбор материала. После аликвотирования вирусы можно длительно хранить при -80 ° C и хранить при -20 ° C или на влажном льду во время активного использования.

Настройка операционного поля, описанного в Основном протоколе 2, занимает примерно 30 минут. Сама стереотаксическая операция может занять от 45 до 90 минут от индукции анестезии до удаления мыши из стереотаксической рамки. Разборка и очистка операционного поля требует дополнительных 30 мин. Восстановление после анестезии кетамином / ксилазином непостоянно, но большинство мышей будут полностью бодрствовать в течение 2 часов после введения анестезии. Мышам следует дать возможность выздороветь при ежедневном контроле за состоянием здоровья в течение 7–10 дней до удаления зажима.Максимальная экспрессия AAV, как правило, занимает 2–3 недели in vivo (см.), А затем сохраняется в течение длительного времени (мы обычно проводим эксперименты до 4 месяцев после первоначального заражения, см.). Пик экспрессии HSV происходит через ~ 3-5 дней после инъекции и полностью исчезает через ~ 10 дней, за исключением долгосрочных векторов HSV, которые ретроградно транспортируются и стабильно экспрессируются в течение длительных периодов времени (см.). Время экспрессии будет зависеть от вируса и конструкции конструкции и должно быть определено эмпирически (см. Протокол поддержки 1).

Проверка IHC, описанная в Основном протоколе 3, занимает приблизительно 2–3 дня, в зависимости от продолжительности и количества контактов с антителами. В первый день срезы следует заблокировать и поместить на ночь в раствор первичных антител. На второй день секции следует подвергнуть воздействию вторичных растворов, если не требуется дополнительное первичное воздействие в течение ночи. Также на второй день (если возможно) секции следует смонтировать, просушить и накрыть крышкой. Монтаж и надевание покрытия занимает 30–60 минут в зависимости от количества прикрепляемых пластин.После того, как крышка соскользнула, слайды можно хранить вдали от света, но снимать в течение недели, чтобы гарантировать целостность флуоресцентного сигнала. Визуализация для проверки размещения занимает около 10 минут на слайд, в зависимости от количества областей мозга и объема документации.

Проверка вестерн-блоттинга, описанная в Альтернативном протоколе 1, занимает приблизительно 2–3 дня. Ткань собирают в первый день, после чего ее можно хранить при -80 ° C или сразу же переработать в лизат. Подготовка и количественное определение лизата занимает примерно 2–3 часа, в зависимости от количества образцов и количественного анализа белка.Электрофорез занимает примерно 90 минут, а перенос белка можно завершить в течение 1-2 часов или в течение ночи при более низком напряжении. Воздействие антител после переноса может занять 1-2 дня (или более) в зависимости от оптимизированного времени воздействия для каждого первичного антитела. Количественный анализ и анализ с использованием двухцветной системы обнаружения LiCor занимает от 30 минут до 1 часа.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Krystal Biotech сообщает о финансовых результатах и ​​достижениях за 2017 год

IND для KB103 для лечения дистрофического буллезного эпидермолиза (DEB) будет подано в марте 2018 г.

IND для KB105 для лечения ламеллярного ихтиоза будет подано в 4 квартале 2018 г.

Компания получила патент USPTO на состав вещества и способ использования в
января 2018 г.

Завод по GMP для производства KB103 и трубопроводной продукции должен быть завершен к I кварталу 2019 года

ПИТТСБУРГ, 12 марта 2018 г. (ГЛОБАЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ) – Krystal Biotech (NASDAQ: KRYS), компания по генной терапии редких дерматологических заболеваний, объявила финансовые результаты за 2017 год и обновленную информацию о прогрессе в своей деятельности.

«2018 год обещает быть продуктивным и захватывающим для Krystal. Наше успешное IPO в прошлом году позволило нам построить полностью интегрированную компанию, занимающуюся открытием, разработкой и поставкой готовых простых в применении хронических методов лечения редких дерматологических заболеваний, которые обеспечивают преобразующие результаты для пациентов и их семей », – сказал Криш С. Кришнан. , Генеральный директор «Кристал Биотех». «Нашей непосредственной целью является выполнение запланированного Фазы 1/2 клинического исследования нашего основного кандидата на продукт KB103 для лечения дистрофического буллезного эпидермолиза, а также подача IND в четвертом квартале на наш второй кандидат на продукт, KB105 для лечения ламеллярной болезни. Ихтиоз.Параллельно с этим мы строим нашу инфраструктуру с целью создания в следующие 12 месяцев GMP-завода в Питтсбурге, штат Пенсильвания, для производства наших трубопроводных продуктов с использованием нашей платформы STAR-D (Skin Targeted Delivery) ».

2017 г. и последние достижения компании

• Патент США № 9877990, выданный USPTO, который охватывает композиции, содержащие векторы вируса простого герпеса (HSV), и способы их использования для обеспечения профилактического, паллиативного или терапевтического облегчения раны, расстройства или заболевания кожи у субъекта.Этот патент на 100% принадлежит Krystal.
• Протокол клинического исследования фазы 1/2 для KB103 для лечения буллезного дистрофического эпидермолиза (DEB) получил разрешение Консультативного комитета по рекомбинантной ДНК (RAC). Компания планирует подать IND для KB103 в марте 2018 года и вскоре после этого начать клинические испытания в DEB.
• KB103 получил статус орфанного лекарства от Управления по разработке орфанных продуктов (OOPD).
• Представлены доклинические данные оценки доставки in vitro, и in vivo HSV-1, опосредованного KB103, на EB2017, 5-й Всемирной конференции по исследованиям ЭБ в Зальцбурге, Австрия.
• Получено финансирование без разводнения на общую сумму 770 000 долларов от Исследовательского партнерства EB (EBRP) и Фонда медицинских исследований EB (EBMRF). Это финансирование было предоставлено после высококонкурентной подачи заявок и процесса отбора под надзором Научно-консультативного совета EBRP (SAB), который состоит из ведущих ученых и врачей.
• Завершено успешное первичное публичное размещение акций, собрав около 40,7 млн ​​долларов чистой выручки.

Финансовые результаты за год, закончившийся 31 декабря 2017 г.

• Денежные средства составили 49 долларов.6 миллионов на 31 декабря 2017 года.
• Расходы на исследования и разработки за год составили 3,2 миллиона долларов.
• Общехозяйственные и административные расходы за год составили 1,6 млн долларов США.
• Чистые убытки за годы, закончившиеся 31 декабря 2017 и 2016 годов, составили 7,9 млн долларов США и 1,2 млн долларов США или (1,48 доллара США) и (1,31 доллара США) на обыкновенную акцию (базовая и разводненная), соответственно.

О KB103
KB103 – ведущий кандидат продукта Krystal, который в настоящее время находится в стадии доклинической разработки и стремится использовать генную терапию для лечения дистрофического буллезного эпидермолиза, или DEB, неизлечимого состояния волдырей, вызванного недостатком коллагена в коже.KB103 представляет собой дефектный по репликации, неинтегрирующийся вирусный вектор, который был сконструирован с использованием вируса HSV-1 с использованием платформы Krystal STAR-D для доставки функциональных генов COL7A1 человека непосредственно в делящиеся и неделящиеся клетки кожи пациентов. Вектор Кристал может проникать в клетки кожи более эффективно, чем другие вирусные векторы. Его высокая полезная нагрузка позволяет ему вмещать большие или множественные гены, а его низкая иммуногенность делает его подходящим выбором для прямой и повторной доставки на кожу.

О платформе для генной терапии STAR-D
Компания Krystal разработала собственную платформу для генной терапии, платформу для целевой доставки кожи или платформу STAR-D, которая состоит из сконструированного вирусного вектора и технологии переноса генов, оптимизированной для кожи. готовые лекарства от дерматологических заболеваний. Компания считает, что платформа STAR-D обеспечивает оптимальный подход для лечения дерматологических состояний из-за природы созданного вирусного вектора HSV-1.Определенные свойства, присущие вирусу HSV-1, в сочетании со способностью стратегически модифицировать вирус в форме, используемой в качестве основы доставки генов, обеспечивают платформу STAR-D несколькими преимуществами по сравнению с другими платформами вирусных векторов для использования в дерматологических приложениях.

О дистрофическом буллезном эпидермолизе, или DEB
Дистрофический буллезный эпидермолиз, или DEB, является неизлечимым, часто смертельным заболеванием, вызывающим образование пузырей на коже из-за недостатка белка коллагена в коже.Это вызвано мутациями в гене, кодирующем коллаген типа VII, или COL7, главном компоненте закрепляющих фибрилл, которые прикрепляют эпидермис к подлежащей дерме и обеспечивают структурную адгезию у нормального человека. Недостаток COL7 у пациентов с DEB вызывает образование волдырей в дерме в результате отделения от эпидермиса. Это делает кожу невероятно хрупкой, что приводит к образованию пузырей или потере кожи при малейшем трении или ударе. Это прогрессивно и невероятно болезненно.

Самая тяжелая форма DEB – это рецессивная DEB, или RDEB, которая вызывается нулевыми мутациями в гене COL7A1. DEB также встречается в форме доминирующего DEB или DDEB, который считается более мягкой формой DEB. Нет известных методов лечения, которые влияли бы на исход любой из форм заболевания, и текущий стандарт ухода за пациентами с DEB ограничивается паллиативным лечением. Krystal разрабатывает KB-103 для лечения широкой популяции DEB, включая рецессивные и доминантные формы заболевания.

О ламеллярном ихтиозе
Ламеллярный ихтиоз (ЛИ) – это аутосомно-рецессивное заболевание, которое проявляется при рождении и присутствует на протяжении всей жизни. Новорожденный рождается в оболочке из коллодиевой мембраны, которая линяет в течение 10-14 дней. При отшелушивании мембраны наблюдается генерализованное шелушение с переменным покраснением кожи. Чешуя может быть тонкой или пластинчатой, напоминающей кожу рыбы. Хотя это заболевание не опасно для жизни, оно уродует и вызывает у пораженных пациентов значительный психологический стресс.Обычно он появляется в первые несколько дней жизни, длится всю жизнь и может быть очень тяжелым.

О компании Krystal Biotech
Krystal Biotech, Inc. (NASDAQ: KRYS) – компания по генной терапии, занимающаяся разработкой и коммерциализацией новых методов лечения пациентов, страдающих дерматологическими заболеваниями. Для получения дополнительной информации посетите http://www.krystalbio.com.

Заявления о перспективах
Этот пресс-релиз включает в себя определенные раскрытия информации, которые содержат «прогнозные заявления», включая, помимо прочего, заявления о разработке наших продуктов-кандидатов, включая KB103 и KB105, включая заявления о наших планах по инициированию клиническое испытание KB103 в 2018 году и подать IND для KB105 в течение этого календарного года, а также наши планы по развитию производственного предприятия GMP в течение следующих 12 месяцев.Вы можете определить прогнозные заявления, потому что они содержат такие слова, как «полагает» и «ожидает». Заявления о перспективах основаны на текущих ожиданиях и предположениях Krystal. Поскольку прогнозные заявления относятся к будущему, они подвержены внутренним неопределенностям, рискам и изменениям в обстоятельствах, которые могут существенно отличаться от тех, которые предусмотрены прогнозными заявлениями, которые не являются ни утверждениями исторических фактов, ни гарантиями или заверениями в отношении будущих результатов. .Важные факторы, которые могут привести к тому, что фактические результаты могут существенно отличаться от тех, что указаны в прогнозных заявлениях, изложены в периодической документации Krystal в Комиссию по ценным бумагам и биржам, включая ее заявление о регистрации в форме S-1 и форме 10-K в соответствии с заголовок «Факторы риска».

КОНТАКТЫ
Эшли Р. Робинсон
LifeSci Advisors
[email protected]

Источник: Krystal Biotech, Inc.

Источник: Krystal Biotech, Inc.

SAB SIMPLEX SUSPENSIJA 30ML

Магазин не будет работать корректно, если куки отключены.

Похоже, в вашем браузере отключен JavaScript. Для наилучшего взаимодействия с нашим сайтом обязательно включите Javascript в своем браузере.

Informējam, ka šajā tīmekļa vietnē tiek izmantotas sīkdatnes, lai uzlabotu lietošanas pieredzi un optimizētu tās darbību.Turpinot lietot šo vietni, tu piekrīti sīkdatņu lietošanas noteikumiem!

Lietošanas Instrukcija

Aktīvā viela

Симетикон

Pirms zāļu ietošanas uzmanīgi izlasiet lietošanas Instrukciju vai atbilstošu informāciju uz iepakojuma.Konsultējumes ar ārstu vai farmaceitu par zāļu lietošanu. Свариги – zāles netiek pieņemtas atpakaļ un tās var atgriezt aptiekā tikai iznīcināšanai.

Uzmanību!

Pārmērīga gāzu veidošanās un uzkrāšanās kuņģa-zarnu traktā (метеоризмы) ar tādiem simptomiem, kā uzpūšanās, pilnuma vai saspīlējuma sajūta pakrūtē u.c .; пастиприната газу вейдошанас пец операциям; sagatavošanās diagnostiskiem izmeklējumiem vēdera apvidū. Lietošana: Zīdaiņiem un no pudeles barojamiem bērniem – katrai barošanas pudelei pievieno 15 pilienus (0,6 мл) суспензии. Maziem bērniem – 15 пилени (0,6 мл) суспензии ēšanas laikā vai pēc ēšanas. Skolas vecuma bērniem (sākot no 6 gadu vecuma): 20-30 пилени (0,8-1,2 мл), pieaugušiem: 30-45 пилени (1,2-1,8 мл). Šīs devas jālieto ik pēc 4-6 stundām, vajadzības gadījumā tās var palielināt.

Antifoaming Agent – обзор

(a) Присадки

Для улучшения характеристик и рабочих характеристик смазочно-охлаждающих жидкостей был разработан ряд присадок. Добавки включают ингибиторы коррозии, граничные смазки, противозадирные смазочные материалы, биоциды, пеногасители, эмульгаторы, диспергаторы и модификаторы индекса вязкости. Некоторые из этих добавок обсуждаются ниже и относятся к различным типам смазочно-охлаждающих жидкостей.Однако подробное обсуждение множества присадок к смазочно-охлаждающим жидкостям невозможно в рамках данной статьи. Присадки, используемые для улучшения смазывающих свойств смазочно-охлаждающих жидкостей, заслуживают особого упоминания, поскольку они важны для понимания состава и классификации смазочно-охлаждающих жидкостей в зависимости от требований к механической обработке.

Граничная смазка – важный механизм снижения трения и возникающих в результате нагрева и сил на границе раздела инструмент-заготовка. В этом типе смазки образуется молекулярная пленка, которая прилипает к поверхности за счет физической или химической адсорбции.Граничные добавки – это органические соединения с сильными дипольными моментами, которые взаимодействуют со свежими металлическими поверхностями, созданными во время обработки. Добавки включают жирные кислоты, спирты, амины и сложные эфиры. Их обычно получают из животных или растительных источников, и они давно используются в качестве смазочно-охлаждающих добавок в смазочно-охлаждающих жидкостях. Проблемы, связанные с использованием некоторых из этих добавок и уходом за жидкостями на водной основе, обсуждаются в разд. 3. Синтетические полиалкиленгликоли (и их сложноэфирные производные) были исследованы в качестве альтернативных смазывающих добавок в смазочно-охлаждающих жидкостях (Brown, 1999).

Противозадирные присадки (EP) отличаются от граничных смазок тем, что они химически реагируют со свежими металлическими поверхностями инструмента и заготовки при повышенных температурах во время резания. Продукты реакции образуют пленки с низкой прочностью на сдвиг, которые изолируют инструмент от заготовки и стружки, тем самым уменьшая трение и износ. Обычно используются три различных типа противозадирных присадок на основе химических соединений серы, хлора и фосфора. Разработка и использование противозадирных присадок для операций по резке металлов было обычным явлением с аналогичными присадками для других типов механических (смазочные материалы для зубчатых передач) и металлообработки (смазочные материалы для волочения).Технические данные и опыт показывают, что эти соединения действуют по одному и тому же основному химическому механизму при механической обработке сплавов на основе железа: соединения вступают в реакцию в зоне резания с образованием сульфидов, хлоридов и фосфатов железа, покрывающих смазочную пленку. Эти пленочные отложения имеют различные температурные области, в которых они эффективны. Кроме того, металлы, отличные от металлов на основе железа, могут не вступать в реакцию и образовывать аналогичные смазочные пленки. Выбор добавки или комбинации этих добавок зависит от сложности процесса обработки и материала детали, о которой идет речь.Смазка при резании металла включает в себя различные механизмы, в зависимости от химического состава поверхности раздела инструмент-заготовка и механики операции обработки. Кроме того, смазочный механизм может значительно меняться в течение цикла обработки в зависимости от скоростей резания и задействованных сил.

Противозадирные присадки для серы обычно классифицируются как реактивные и инертные на основании их способности вступать в реакцию с медью и образовывать коррозию и образование пятен при определенных температурных условиях испытаний (AAMA 1998).Реактивные добавки легко вступают в реакцию с медью при 38 ° C, в то время как более сильно связанные формы серы практически нереактивны в этих условиях. Реактивные добавки включают элементарную серу, сульфурированные жиры и олефины, содержащие лабильные полисульфидные фрагменты. К инертным добавкам относятся моносульфиды и дисульфиды. В общем, использование активных соединений серы ограничено в операциях по резке металлов для предотвращения коррозии и окрашивания станка или заготовки вдали от зоны резания.Кроме того, активные соединения серы имеют тенденцию выделять резкие запахи и нежелательны для окружающей среды на рабочем месте. Тепла, выделяемого на стыке стружки и инструмента, обычно достаточно для создания противозадирного эффекта с инертными добавками серы, что делает эти добавки предпочтительными при резке металлов. Добавки серы обычно используются при тяжелых операциях механической обработки с использованием смазочно-охлаждающих жидкостей, где поверхность раздела стружка-инструмент достигает высоких температур. Эффект EP серы, как полагают, эффективен от примерно 200 ° C до примерно 500 ° C.

Добавки хлора обычно представляют собой хлорированные парафины, олефины и сложные эфиры. Как правило, они более реакционноспособны, чем «инертные» серные добавки. Обычно они образуют противозадирные смазочные пленки при температуре от примерно 100 ° C до примерно 400 ° C. Сульфохлорированные углеводородные и сложноэфирные присадки были разработаны для объединения противозадирных свойств серы и хлора в одном пакете присадок. Эти добавки могут действовать в диапазоне температур, которые могут возникать в типичном цикле обработки. Есть опасения по поводу использования хлорированных добавок.Добавки, содержащие свободный хлорид-ионный остаток или реагирующие с образованием свободного хлорида вдали от границы раздела инструмент-стружка, могут быть очень коррозионными. Следует принимать во внимание оценку жидкостей, содержащих эти типы присадок, на предмет коррозионного воздействия (см. Разделы 1 и 2).

Соединения фосфора используются в качестве противозадирных присадок, обычно в виде органических сложных эфиров фосфорной кислоты. Обычно они эффективны в диапазоне 60–300 ° C. Сложные фосфорные эфиры действительно находят применение в тяжелых жидкостях для резки масла.Они реже используются в жидкостях на водной основе, поскольку могут быть гидролитически нестабильными и оказывать нежелательное влияние на свойства жидкости. Сложные фосфатные эфиры также могут быть проблемой с точки зрения здоровья и окружающей среды (Marino and Placek, 1999).

sab simplex – Немецкий перевод – Linguee

Департамент здравоохранения штата Техас – Тесты микробиологической лаборатории